Beeinflussung des Zellwachstums durch virale Proteine mit dem Bindungsmotiv LXCXE:
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2004
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| adam_text | Inhaltsverzeichnis
1. Einleitung 7
1.1. Vorwort 7
1.2. Zellteilung und Zellwachstum 7
1.3. Zellulare Wachstumsregulation 9
1.4. Zellzyklusbeeinflussung durch Viren 13
1.5. Verwendete virale Proteine 16
1.5.1. Polyomavirus SV40-T 17
1.5.2. Polyomavirus APV-T 18
1.5.3. Rubella-NS2 19
1.6. Molekulare Bindungsfähigkeit der verwendeten viralen Proteine 20
1.7. Methodische Grundlagen 20
1.7.1. Ludferasemessung 20
1.7.2. Durchflusszytometrie 21
1.8. Fragestellung und Zielsetzung der Arbeit 23
2. Material 24
2.1. Standardreagenzien 24
2.2. Zellkulturen 24
2.3. Plasmide der viralen Proteine 24
2.4. Luciferasemessung 25
2.5. FACS-Gerät und Transfektionsmarker 25
3. Methoden 26
3.1. Arbeitsumgebung 26
3.2. Vervielfältigung von DNA 26
3.2.1. Transformation von Bakterien 26
3.2.2. ONA-PräparationmitdemQuiagen-Kit 26
3.3. Transfektion von Plasmiden 27
3.4. Arbeiten mit Zellkulturen 28
3.4.1. Kultivierung adhärent wachsender Zellen 28
3.4.2. Einfrieren und Auftauen von Zellen 29
3-4.3 Zellkultur mit dichtearretierten Zellen 29
3.4.4. Zellkultur unter serumfreien Bedingungen 29
3.4.5. Zellkultur unter normalen Serum Bedingungen 30
3 5 Messung des Luciferasereporters 30
3.5.1. Cyclin-B2-Messung zur Bestimmung des Zellwachstums 30
3 5 2 Kontrolle der Transfektion durch Renillaluciferase 31
3.5.3. Standardisierung der Luciferasemessungen 31
3.6. Durchflusszytometrie 31
3.6.1. DNA-Färbung mit Propidium lodid 31
3.6.2. Wahl der Messkanäle 32
3.6.3. Impulsanalyse 32
3.6.4. Einstellungen des Durchflusszytometers 33
3.6.5. Einschlusskriterien der Zellzyklusanalyse 35
4
Inhaltsverzeichnis
3.6.6. Computergestutzte Datenanalyse 35
3.6.7. Berechnung der relativen Wachstumsänderung 37
3.7. Vergleichskriterien von Luciferase- und Durchflusszytometnemessungen 37
4. Ergebnisse 38
4.1. Etablierung der Messmethoden 38
4.1.1. Herstellen eines dichtearretierten Monolayers 38
4.1.2 Transfektion des Monolayers 39
4.1.3. Kontrolle der Luciferasemessungen 39
4.1.4. Verminderung von Zellaggregationen 40
4.1.5. Transfektionsnachweis durch GFP 41
4.1.6. Farbeprotokoll zur Messung von GFP und Pl 43
4.1.7. Geeignete Zellen für die Zellzyklusanalyse 44
4.1.8. ModFit-LT Einstellungen und Analysefehler 47
4.2. Beeinflussung der Cyclin-B2-Aktivität durch virale Proteine 49
4.2.1. Aktivitätsbestimmung durch Luciferasemessungen 49
4.2.2. Relative Cyclin-B2-Aktivitat 50
4.3. Beeinflussung der Zellzyklusverteilung durch virale Proteine 53
4.3.1. Durchflusszytometrische Bestimmung der absoluten
Wachstumsänderung 53
4.3.2. Durchflusszytometrische Bestimmung der relative Wachstumsanderung 54
4.4. Zusammenfassung der Ergebnisse von Luciferase- und
Durchflusszytometnemessungen 58
5. Diskussion 60
5.1. Wahl geeigneter Zellkulturen 60
5.1.1 Zellkultur mit NIH-3T3- Mausfibroblasten 60
5.1.2. Zellkultur mit SAOS2-Osteosarkomzellen 61
5.1.3. Genstatus der C33A-Zellen und die Auswirkung auf die Ergebnisse 62
5.2 Kontrolle der Luciferasemessungen durch CMV-Renillaluciferase 62
5.3 Wachstumsmessung durch modifizierten Proliferationsassay 63
5.4. Schritte zur Optimierung des FACS-Färbeprotokolls 64
5.4.1. Markierung der Zelle mit GFP und DNA-Quantifizierung durch Pl 64
5.4.2. Alternativen zu GFP und Pl 66
5.5. Objektive Zellzyklusanalyse durch ModFit-LT 67
5.6. Beeinflussung des Zellwachstums durch virale Proteine - Luciferasemessung 67
5.6.1. Cyclin-B2-Aktivitätssteigerung bei SV40-T/wt und SV40-T/K1 67
5 6.2. Cyclin B2-Aktivitat bei APV-T 69
5.7. Zellzyklusanalyse zur Bestimmung der Wachstumsbeinflussung durch virale
Proteine 69
5.7.1. Wachstumssteigerung durch SV40-T 69
5 7.2. Wachstumsbeeinflussung durch APV-T 71
5.7.3. Wachstumshemmung durch Rubella-NS2 72
5.8. Vergleichende Betrachtung 74
5.9. Zellwachstum bei intakter p53-Bindungsstelle 74
6. Schlussfolgerung 76
5
Inhaltsverzeichnis
7. Zusammenfassung 78
8. Anhang 80
8.1. Farbeprotokoll zur Zellzyklusanalyse 80
8.2. Materialien und Geräte 81
8.2.1. Chemikalien 81
8.2.2. fertige Chemikalien-Zusammensetzungen (Kits) 82
8.2.3. Enzyme 82
8.2.4. Puffer und Lösungen 82
8.2.5. Nährmedien 83
8.2.6. Transfektionsmischung 84
8.2.7. Plasmide 84
8.2.8. Bakterienstamm 85
8.2.9. Zelllinien 85
8.2.10. Verbrauchsmaterial 86
8.2.11. Technische Geräte 86
8.2.12. Software 87
8.3. Durchflusszytometriedaten 88
8.4. weitere Messdaten 90
9. Literaturverzeichnis 94
10. Erklärung Ober die eigenständige Abfassung der Arbeit 99
11. Lebenslauf 100
12. Danksagung 101
6
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