Untersuchungen zur konstitutiven Aktivierung des Signaltransduktionsproteins Ras und Ras-assoziierten Signalkaskaden bei Patienten mit akuter myeloischer Leukämie:
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2003
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| adam_text | Titel: Untersuchungen zur konstitutiven Aktivierung des Signaltransduktionsproteins Ras und Ras-assoziierte
Autor: Ehmann, Falk H. G.
Jahr: 2003
Inhaltsverzeichnis
Inhaltsverzeichnis Seite
1. Arbeitshypothese und Fragestellung 1
2. Einleitung
2.1. Das hämatopoetische System
2.1.1. Die Hämatopoese (Differenzierung) 2
2.1.2. Regulation der Proliferation 6
2.1.3. Der programmierte Zelltod (Apoptose)
2.2. Signaltransduktion in hämatopoetischen Zellen
2.2.1. Hämatopoetische Wachstumsfaktoren und Rezeptoren 10
2.2.2. Die GM-CSF/IL-3-abhängige Signaltransduktion 15
2.2.2.1. JAK/STAT-Signalkaskade 19
2.2.2.2. PI-3-Kinase/Akt-Signalkaskade 21
2.2.2.3. Die Ras/Raf/MAP-Kinase-Signalkaskade 24
2.2.2.3.1. Das Ras-Protein 25
2.3. Leukämien
2.3.1. Einteilung und Definition der Leukämien 28
2.3.2. Akute myeloische Leukämie (AML) 29
Einteilung, Klinik und Molekularbiologie
2.3.3. Entstehung der Akuten myeloischen Leukämie 32
2.3.3.1. Dysregulation im hämotopoetischen System 32
2.3.3.2. Leukämogenese 34
3. Material und Methoden
3.1. Material
3.1.1. Chemikalien 37
3.1.2. Puffer und Stammlösungen 37
3.1.3. Antikörper 38
3.1.4. Enzyme und Reaktionskits 3 9
3.1.5. Bakterienstämme 3 9
3.1.6. Zellen 39
3.1.6.1. Zelllinien 39
3.1.6.2. primäre Zellen 41
Inhaltsverzeichnis
3.1.7. Nukleinsäuren 42
3.1.7.1. Vektoren 42
3.1.7.2. DNA-Oligonukleotide 42
3.1.8. Geräte 42
3.1.9. Verbrauchsmaterialien 43
3.2. Zellbiologische Techniken
3.2.1. Bakterienkulturen 44
3.2.2. Herstellung kompetenter Bakterien 44
3.2.3. Präparation mononukleärer Zellen 45
3.2.4. Zellkultur 45
3.2.4.1. Stammhaltung und Vermehrung 45
3.2.4.2. Einfrieren von Zellen 45
3.3. Molekularbiologische Techniken
3.3.1. Plasmid-DNA-Präparation 46
3.3.2. Ligation 46
3.3.3. Transformation 46
3.3.4. Sequenzierungen 47
3.3.5. cDNA-Synthese (Erststrangsysnthese) 47
3.3.6. PCR-Amplifikation von cDNA 47
3.3.7. Arbeiten mit Agarosegelen 48
3.3.7.1. DNA-Agarosegele 48
3.3.7.2. Isolierung von DNA-Fragmenten aus Agarosegelen 48
3.4. Proteinbiochemische Techniken
3.4.1. Herstellung von Proteinlysaten 49
3.4.2. Proteinbestimmung 50
3.4.3. SDS-PAGE 50
3.4.4. Coomassiefarbung von Proteingelen 51
3.4.5. Western-Blot 51
3.4.6. ARIA 53
Inhaltsverzeichnis
4. Ergebnisse
4.1. Semiquantitative Bestimmung der zellulären Mengen an Ras-GTP
mittels ARIA {Activated Ras Interaction Assay)
4.1.1. Expression und Aufreinigung der Ras-Bindungs-Domäne 55
(RBD) von Raf als Glutathion-S-Transferase (GST)-
Fusionsprotein
4.1.2. Quantifizierung und Expression der GST-RBD- 57
Fusionsproteine
4.1.3. Die Ras-Bindungs-Domäne bindet spezifisch an p21Ras 58
4.1.4. Stimulationsabhängiger Anstieg der Bindung von p21Ras 59
an die Ras-Bindungs-Domäne (RBD) von Raf
4.2. Untersuchungen zur Aktivierung von Ras und des Ras-assoziierten
PI-3-Kinase/Akt-Signalweges in akuten myeloischen Leukämiezellen
4.2.1. Bestimmung der Mengen an Ras-GTP mittels ARIA 61
{Activated Ras Interaction Assay)
4.2.2. Sequenzanalyse der H-, K- und N-ras-Gene 65
4.2.3. Analyse der Phosphorylierung von Akt (Proteinkinase B) 68
4.3. Untersuchungen zur Aktivierung von Ras, MAP-Kinase und Akt in
wachstumsfaktorunabhängigen Mutanten der in Abhängigkeit von
GM-CSF-wachsenden TF-1-Zelllinie
4.3.1. Bestimmung der Mengen an Ras-GTP mittels ARIA 71
(Activated Ras Interaction Assay)
4.3.2. Bestimmung der Phosphorylierung der MAP-Kinase 73
4.3.3. Bestimmung der Phosphorylierung von Akt (Proteinkinase B) 75
4.4. Untersuchungen zur Aktivierung von Ras, MAP-Kinase und Akt in
wachstumsfaktorunabhängigen Mutanten der in Abhängigkeit
von Interleukin-3 wachsenden FDC-P1(M)-Zelllinie
4.4.1. Bestimmung der Mengen von Ras-GTP mittels ARIA 77
4.4.2. Bestimmung der Phosphorylierung der MAP-Kinase 79
4.4.3. Bestimmung der Phosphorylierung von Akt (Proteinlinase B) 81
Inhaltsverzeichnis
5. Diskussion
5.1. Die mögliche Bedeutung der Aktivierung von Ras und der Ras- 83
assoziierten Signalwege Raf/MEK/MAP-Kinase und
PI-3-Kinase/Akt für die Entstehung der AML
(Akute Myeloische Leukämie)
5.2. Untersuchungen zum Einfluss von Ras und der Ras-assoziierten 91
Signalwege Raf/MEK/MAP-Kinase und PI-3-Kinase/Akt für den
Erwerb der Faktorunabhängigkeit hämatopoetischer Zellen.
5.3. Zusammenfassender Vergleich der Aktivierung von Ras, 102
MAP-Kinase und Akt in den verschiedenen untersuchten
Zellsystemen untereinander
5.4. Ausbück 104
6. Zusammenfassung 106
7. Literaturverzeichnis und 107
Abkürzungsverzeichnis 125
8. Danksagung und Lebenslauf
9. Erklärung
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