Funktion des Transmembranrezeptors Notch1 während der antigenabhängigen Phase der B-Zelldifferenzierung:
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2004
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Inhaltsverzeichnis
1. Zusammenfassung 1
2. Einleitung 2
2.1 Entwicklung von B-Lymphozyten 2
2.2 Die humorale Immunantwort 5
2.2.1 Aktivierung von B-Zellen durch thymusunabhängige Antigene 5
2.2.2 Aktivierung von B-Zellen durch thymusabhängige Antigene 7
2.2.3 Rolle spezifischer Transkriptionsfaktoren im Verlauf der
humoralen Immunantwort 9
2.3 Die Transmembranrezeptoren der Notch Familie 11
2.3.1 Struktureller Aufbau der Noten-Proteine 11
2.3.2 Notch-vermittelteSignaltransduktion 13
2.3.3 Funktion von Notch im Verlauf zellulärer Entwicklungs¬
prozesse 17
2.3.4 Notch im Verlauf lymphoider Entwicklungsprozesse 18
2.3.4.1 Expression von Notch-Rezeptoren in B-Lymphozyten 18
2.3.4.2 Funktion von Notch im Verlauf der frühen und
späten B-Zellentwicklung 19
3. Aufgabenstellung 22
4. Ergebnisse 23
4.1 Expression von Notch-Rezeptoren in immortalisierten B-Zelllinien 23
4.1.1 Nachweis der Expression von Notch-Rezeptoren in
immortalisierten B-Zelllinien 23
4.1.2 Nachweis der Notch 1 Proteinsynthese in immortalisierten
B-Zelllinien 26
4.1.3 Nachweis der Expression des Notch-spezifischen Zielgens
Hes1 in immortalisierten B-Zelllinien 27
4.2 Expression von Notch-Rezeptoren in primären B-lymphoiden
Zellen der Milz 29
Inhaltsverzeichnis
4.2.1 Etablierung eines Zellkultursystems zur Analyse
von terminal differenzierenden B-Zellen 29
4.2.1.1 Überprüfung der Reinheit von isolierten B-Zellen
aus der Milz 31
4.2.1.2 Überprüfung der antigenabhängigen Differenzierung
der aktivierten murinen B-Zellen der Milz 33
4.2.1.3 Überprüfung der IgM-Sekretion der aktivierten
B-Zellen der Milz 35
4.2.2 Expression von Notch-Transmembranrezeptoren innerhalb
des experimentellen Systems 37
4.2.2.1 Nachweis der Expression von Notch-Rezeptoren
in isolierten und aktivierten B-Zellen 37
4.2.2.2 Nachweis der endogenen Noten 1 Proteinsynthese
in isolierten und aktivierten B-Zellen 40
4.3 Untersuchungen zur funktionellen Aktivität von NotcM in isolierten
murinen B-Zellen der Milz 42
4.3.1 Analyse der Expression und Synthese von Hes1 in
isolierten und aktivierten B-Zellen 42
4.3.2 Auswirkung der g-Sekretasehemmung auf die Aktivierung
isolierter muriner B-Lymphozyten 45
4.3.2.1 Titration des y-Sekretaseinhibitors 45
4.3.2.2 Einfluß dery-Sekretasehemmung auf die
Differenzierung von B-Zellen zu Plasmablasten 48
4.3.2.3 Einfluß dery-Sekretase Hemmung auf die
Sekretion von IgM 50
4.3.2.4 Einfluß der y-Sekretasehemmung auf das
Zellwachstum 53
4.3.2.5 Effekt der y-Sekretasehemmung auf die
Expression von NotcM 55
4.3.2.6 Effekt der y-Sekretasehemmung auf die
Expression von Hes1 57
4.4 Analyse der Proteininteraktion zwischen NotcM und Pax5 58
Inhaltsverzeichnis
4.4.1 Nachweis der Synthese von Pax5 innerhalb des
experimentellen Systems 59
4.4.2 Nachweis der Proteininteraktion von Notchi und Pax5 61
5. Diskussion 65
5.1 Expression von Notch-Rezeptoren in immortalisierten B-Zelllinien 65
5.2 Expression und Aktivität von Notch-Rezeptoren in isolierten und
aktivieren B-Lymphozyten der Milz 67
5.3 Konsequenzen der Notch-vermittelten Signaltransduktion
in polyklonal aktivierten B-Zellen 70
5.4 Interaktion von NotcM und Pax5 73
6. Material und Methoden 76
6.1 Material 76
6.1.1 Oligonukleotide 76
6.1.2 Zelllinien 77
6.1.3 Antikörper 77
6.1.4 Versuchstiere 78
6.2 Methoden 79
6.2.1 Zellkultur 79
6.2.1.1 Kultivierung von Zellen 79
6.2.1.2 Ernten von Zellen und Zellzahlbestimmung 79
6.2.1.3 Bestimmung des Zellwachstums mittels
durchflußzytometrischer Analysen 80
6.2.1.4 Kryokonservierung von Zellen 80
6.2.1.5 Auftauen von Zellen 81
6.2.2 Präparation von murinen B-Lymphozyten aus dem
Knochenmark und der Milz 81
6.2.2.1 Präparation des Knochenmarks und der Milz
aus der Maus 81
6.2.2.2 Lyse der Erythrozyten 81
I nhaltsverzeichn is
6.2.2.3 Selektion von B-Zellen aus Knochenmarks¬
und Milzzellsuspensionen mittels magnetischer
Zellseparation (MACS) 82
6.2.2.4 Aktivierung der isolierten reifen B-Lymphozyten
der Milz 82
6.2.2.5 Hemmung derv-Sekretaseaktivität 83
6.2.2.6 Bestimmung der Reinheit und der B-Zell¬
differenzierung mittels durchflußzytometrischer
Analysen 83
6.2.3 Analyse des Zellkulturüberstandes 84
6.2.3.1 Immunpräzipitation 84
6.2.3.2 ELISA 85
6.2.4 Analyse zellulärer Proteine 86
6.2.4.1 Herstellung von Zellextrakten für
Western-Blot-Analysen 86
6.2.4.2 Herstellung von Zellextrakten für
Immunpräzipitationen 86
6.2.4.3 Immunpräzipitation 87
6.2.4.4 GST-Pull-Dcwn-Assay 87
6.2.4.5 SDS-Polyakrylamid-Gelelektrophorese
(SDS-PAGE) 88
6.2.4.6 Western-Blot-Analysen 89
6.2.5 Analyse von zellulärer RNA 91
6.2.5.1 Präparation zellulärer RNA 91
6.2.5.2 cDNA-Synthese 92
6.2.5.3 Polymerase-Ketten-Reaktion (PCR) 92
6.2.5.4 Agarose-Gelelektrophorese 93
6.2.5.5 Northem-Blot-Analyse 94
7. Verzeichnisse 96
7.1 Literaturverzeichnis 96
7.2 Abkürzungen 116
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