Einfluss von Johanniskraut-Extrakt auf die Glutamat-induzierte Toxizität in neuronalen Zellen:
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| Format: | Buch |
| Sprache: | German |
| Veröffentlicht: |
München
Verl. Dr. Hut
2004
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| Ausgabe: | 1. Aufl. |
| Schriftenreihe: | Biochemie
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| Beschreibung: | Zugl.: München, Techn. Univ., Diss., 2004 |
| Beschreibung: | V, 132 S. Ill., graph. Darst. 21 cm, 207 gr. |
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I Einleitung 1
1 Neurodegenerative Erkrankungen und Beteiligung von reaktiven
Sauerstoffspezies 1
2 Oxidativer Stress und glutamaterges System 4
2.1 Glutamatrezeptoren und NMDA vermittelte Exzitotoxizität 5
2.2 Glutamat/Cystin Antiporter Xc" und oxidative Glutamat Toxizität („Oxytosis").7
3 Depressive Erkrankung und Johanniskraut {Hypericum perforatum L.) 10
4 Ziel der Arbeit 14
II Material und Methoden 15
1 Material 15
1.1 Chemikalien 15
1.2 Extrakte 18
1.3 Nervenzellen 18
1.4 Kommerzielle Zellkulturmedien und Zusätze 19
1.5 Rezepturen für Medien und Puffer 19
1.6 Gebrauchsmaterial 20
1.7 Geräte 21
2 Methoden 22
2.1 Erzeugung einer neuronalen Primärkultur aus embryonalem Neokortex 22
II
2.2 Kultivierung der HT22 Zelllinie 23
2.3 Proteinbestimmung nach Bradford 25
2.4 MTT Testsystem 26
2.5 Färbung mit Trypanblau 27
2.6 Lichtmikroskopische Betrachtung der Zellmorphologie 27
2.7 Griess Reaktion 28
2.8 HPLC Analytik der Inhaltsstoffe von Hypericum perforatum L. Extrakt 29
2.9 Imaging System 32
2.10 Fluoreszenzspektroskopie 35
2.11 Kapillarelektrophorese 36
2.12 Nachweis freier Sulfhydrylgruppen 42
2.13 Statistische Auswertung der Messergebnisse 44
III Ergebnisse 45
1 Zytotoxizitätsuntersuchungen an neuronalen neokortikalen
Primärkulturen 45
1.1 Morphologische Differenzierung der Neuronen 45
1.2 Einfluss von HPE auf die Glutamat induzierte Toxizität in NMDA
Rezeptoren exprimierenden Neuronen (DIV 14) 47
1.3 Einfluss von HPE auf die Glutamat induzierte Toxizität in NMDA
Rezeptoren exprimierenden Neuronen nach Antagonisiemng der
Rezeptoren (DIV 14) 48
1.4 Einfluss von HPE auf die Glutamat induzierte Toxizität in nicht NMDA
Rezeptoren exprimierenden Neuronen 49
IM
1.5 Zusammenfassung 51
2 Zytotoxizitätsuntersuchungen an neuronalen HT22 Zellen 51
2.1 Einfluss von HPE auf die Glutamat induzierte oxidative Toxizität 51
2.1.1 Einfluss von HPE auf HT22 Zellen Bestimmung der Zellzahl mit MTT 53
2.1.2 Einfluss von HPE auf HT22 Zellen Bestimmung der Zellzahl mit Trypanblau.55
2.1.3 Mikroskopische Untersuchung der Zellmorphologie 56
2.1.4 Untersuchungen mit Inhaltsstoffen aus Hypericum perforatum L 58
2.1.5 Zusammenfassung 61
2.2 Einfluss von HPE in einer Kinetik auf die Glutamat induzierte oxidative
Toxizität 61
2.2.1 Inkubation mit HPE vor Glutamat Exposition 62
2.2.2 Inkubation mit HPE nach Glutamat Exposition 64
2.2.3 Zusammenfassung 66
2.3 NO Bildung in HT22 Zellen bei Glutamat Exposition 67
2.4 H2O2 Toxizität in HT22 Zellen 68
3 HPLC Analyse des Hypericum perforatum L. Extraktes 70
4 Mögliche Fehlerquellen bei der Anwendung des MTT Testsystems 72
5 Änderung der intrazellulären Ca2* Konzentration im HT22 Zellmodell 79
5.1 Untersuchungen der Fluoreszenzstabilität mittels Calcein 79
5.2 Fluoreszenzintensität bei Färbung der HT22 Zellen mit Calcium Green und
FuraRed 80
5.3 Zusatz eines membranpermeablen c GMP Analogon zur Glutamat
Exposition 85
5.4 Fluoreszenzmessungen mit HPE in HT22 Zellen 86
IV
5.5 Untersuchung des Ca2+ Einstroms während der h^CVInkubation
bei Behandlung der HT22 Zellen mit Quercetin 88
6 Energiestatus der neuronalen HT22 Zellen 90
6.1 Charakterisierung der im CE Elektropherogramm detektierten Substanzen.90
6.2 Quantitative Bestimmung von Purinnucleosiden und nucleotiden 92
6.2.1 ATP Bestimmung in HT22 Zellen nach Glutamat Exposition 93
6.2.2 ADP Bestimmung in HT22 Zellen nach Glutamat Exposition 94
6.2.3 Berechnung der „verwertbaren Energie" 95
6.2.4 GTP Bestimmung in HT22 Zellen nach Glutamat Exposition 96
6.3 Bestimmung von Glutathion (GSH und GSSG) 98
IV Diskussion 103
1 Einfluss von Johanniskraut Extrakt (HPE) auf die Glutamat induzierte
Toxizität in neuronalen Zellen 103
1.1 Glutamat induzierter neuronaler Zelltod und der Einfluss von HPE 104
1.2 Einfluss von HPE auf intrazelluläres Glutathion 110
1.3 Einfluss von HPE auf neuronales GTP 113
1.4 Einfluss von HPE auf den neuronalen Energiestatus (ATP, ADP) 115
2 Einfluss von Quercetin auf die H2O2 induzierte Änderung der
intrazellulären Ca2* Konzentration und auf den Zelltod 116
V Zusammenfassung 119
VI Literatur 121 |
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