Monoterpensynthasen in Blättern der Fichte (Picea abies (L.) Karst.) und der Steineiche (Quercus ilex L.): Charakterisierung, KLonierung und zeitliche Variabilität
Gespeichert in:
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| Format: | Abschlussarbeit Buch |
| Sprache: | German |
| Veröffentlicht: |
Aachen
Shaker
2001
|
| Schriftenreihe: | Schriftenreihe / Fraunhofer-Institut Atmosphärische Umweltforschung
67 |
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INHALTSVERZEICHNIS
1.
EINLEITUNG
1
1.1.
VORKOMMEN
VON
MONOTERPENEN
.
1
1.2.
BIOLOGISCHE
BEDEUTUNG
VON
MONOTERPENEN
.
3
1.3.
BEDEUTUNG
DER
MONOTERPENEMISSION
FUER
DIE
CHEMIE
DER
ATMOSPHAERE
.
5
1.4.
BIOSYNTHESE
VON
MONOTERPENEN
.
6
1.5.
MONOTERPENSYNTHASEN
.
12
1.6.
REGULATION
DER
MONOTERPENBILDUNG
.
14
1.7.
DIE
FICHTE
UND
DIE
STEINEICHE
.
16
1.8.
ZIELE
DER
ARBEIT
.
17
2.
MATERIAL
UND
METHODEN
.
19
2.1.
PFLANZENMATERIAL
UND
ANZUCHTBEDINGUNGEN
.
19
2.1.1.
FICHTE
(PICEA
ABIES
(L_)
KARST.)
.
19
2.1.1.1.
FICHTENKEIMLLNGE
.
19
2.1.1.2.
FREILANDBAEUME
DER
FICHTE
.
20
2.1.2.
STEINEICHE
(QUERCUS
HEX
L.)
.
21
2.1.2.1.
GETOPFTE
STEINEICHEN
.
21
2.1.2.2.
FREILANDBAEUME
DER
STEINEICHE
.
22
2.2.
FREILANDVERSUCHE
.
22
2.2.1.
FREILANDVERSUCHE
AN
FICHTEN
.
22
2.2.2.
FREILANDVERSUCHE
MIT
DER
STEINEICHE
.
24
2.3.
CHEMISCHE
SYNTHESE
VON
GERANYLDIPHOSPHAT
(GDP)
.
25
2.3.1.
SYNTHESE
VON
GERANYLDIPHOSPHAT
.
25
2.3.2.
HASH-CHROMATOGRAPHIE
ZUR
ISOLIERUNG
DER
DIPHOSPHATE
.
26
2.3.3.
DETEKTION
DER
PHOSPHATE
MITTELS
DUENNSCHICHTCHROMATOGRAPHIE
.
26
2.4.
BIOCHEMISCHE
METHODEN
.
27
2.4.1.
ENTSALZUNG,
KONZENTRIERUNG
UND
ANREINIGUNG
VON
PROTEINEXTRAKTEN
.
27
2.4.2.
SPEKTRALPHOTOMETRISCHE
BESTIMMUNG
DER
PROTEINKONZENTRATION
.
28
2.4.3.
STANDARDMETHODE
ZUR
HERSTELLUNG
VON
BLATTEXTRAKTEN
.
29
2.4.4.
STANDARDENZYMTEST
DER
MONOTERPENSYNTHASEN
IN
ACHTE
UND
STEINEICHE
.
30
2.4.5.
GASCHROMATOGRAPHISCHE
ANALYTIK
DER
MONOTERPENSYNTHASEN
.
31
2.4.5.1
.
IDENTIFIZIERUNG
UND
QUANTIFIZIERUNG
.
2.4.5.2.
BERECHNUNG
DER
MONOTERPENSYNTHASE-AKTIVLTAET
.
2.4.6.
BESTIMMUNG
DER
GDP-PHOSPHATASE-AKTIVITAET
.
2.4.7.
BESTIMMUNG
ENDOGENER
MONOTERPENE
AUS
ACHTENNADELN
.
2.4.7.1.
EXTRAKTION
.
2.4.7.2.
GASCHROMATOGRAPHISCHE
ANALYSE
.
2.4.7.2.1.
IDENTIFIZIERUNG
UND
QUANTIFIZIERUNG
.
2.4.8.
BESTIMMUNG
DES
NATIVEN
MOLEKULARGEWICHTES
MITTELS
GELFILTRATION
.
2.5.
MOLEKULARBIOLOGISCHE
METHODEN
.
2.5.1.
VERWENDETE
E.
CO//-STAEMME
UND
VEKTOREN
.
2.5.2.
ISOLIERUNG
DER
GESAMT-RNA
AUS
BLAETTERN
DER
STEINEICHE
.
2.5.3.
KONZENTRATIONSBESTIMMUNG
UND
REINHEITSABSCHAETZUNG
VON
NUKLEINSAEUREN
.
2.5.4.
ELEKTROPHORESE
VON
NUKLEINSAEUREN
.
2.5.5.
ISOLIERUNG
DER
MRNA
.
2.5.6.
HERSTELLUNG
VON
EINZELSTRAENGIGER
UND
DOPPELSTRAENGIGER
CDNA
.
2.5.7.
SPEZIFISCHE
AMPLIFIKATION
VON
GENEN
AUS
EINEM
CDNA-GEMISCH
.
2.5.7.1.
AUSWAHL
GENSPEZIFISCHER
PRIMER
FUER
MONOTERPENSYNTHASEN
.
2.5.7.2.
BEDINGUNGEN
DER
PCR
.
2.5.8.
KLONIERUNG
DER
PCR-FRAGMENTE
IN
E.
COLI
.
2.5.8.1.
UGATION
.
2.S.8.2.
HERSTELLUNG
KOMPETENTER
ZELLEN
.
2.5.8.3.
TRANSFORMATION
.
2.5.8.4.
SELEKTION
UND
ANZUCHT
POSITIVER
KLONE
.
2.5.S.5.
PRAEPARATION
VON
PLASMID-DNA.
.
2.5.8.6.
RESTRIKTIONSVERDAU
VON
PLASMID-DNA
.
2.5.9.
DNA-SEQUENZIERUNG
.
2.5.9.1.
CYCLE
SEQUENCING
MIT
TERMINATOREN
.
2.5.9.2.
KAPILLARELEKTROPHORESE
.
2.5.10.
SEQUENZDATENANALYSE
.
2.6.
CHEMIKALIEN
UND
KITS
.
2.7.
VERBRAUCHSMATERIALLEN
.
67
II
3.
ERGEBNISSE
_
68
3.1.
NACHWEIS
DER
MONOTERPENSYNTHASE-AKTIVITAET
UEBER
HEAD
SPACE-ANALYSE
.
68
3.1.1.
CHARAKTERISIERUNG
DER
MONOTERPENSYNTHASE-AKTIVITAET
AUS
BLATTEXTRAKTEN
DER
FICHTE
.
73
3.1.1.1.
WAHL
DES
EXTRAKTIONS
UND
TESTPUFFERS
.
73
3.1.1.2.
SUBSTRATABHAENGIGKEIT
.
75
3.1.1.3.
ZEIT
UND
PROTEINABHAENGIGKEIT
.
78
3.1.1.4.
PH-ABHAENGIGKEIT
.
79
3.1.1.5.
LONENABHAENGIGKEIT
.
81
3.1.1.6.
TEMPERATURABHAENGIGKEIT
.
82
3.1.2.
CHARAKTERISIERUNG
DER
MONOTERPENSYNTHASE-AKTIVITAET
AUS
BLATTEXTRAKTEN
DER
STEINEICHE
.
85
3.1.2.1.
WAHL
DES
GEEIGNETEN
EXTRAKTIONS
UND
TESTPUFFERS
.
85
3.1.2.2.
SUBSTRATABHAENGIGKEIT
.
88
3.1.2.3.
ZEIT
UND
PROTEINABHAENGIGKEIT
.
91
3.1.2.4.
PH-ABHAENGIGKEIT
.
92
3.1.2.5.
LONENABHAENGIGKEIT
.
93
3.1.2.6.
TEMPERATURABHAENGIGKEIT
.
94
3.1.3.
VERGLEICHENDE
BETRACHTUNGEN
.
96
3.2.
NATIVE
MOLEKULARGEWICHTE
VON
MONOTERPENSYNTHASEN
DER
FICHTE
UND
DER
STEINEICHE
.
99
3.3.
ISOLIERUNG
VON
MONOTERPENSYNTHASE-GENEN
AUS
DER
STEINEICHE
.
102
3.3.1.
AMPLIFIKATION
EINES
MONOTERPENSYNTHASE-GENSEGMENTS
MITTELS
DEGENERIERTER
PRIMER
.
102
3.3.2.
AMPLIFIZIERUNG
DES
5
'
-
UND
3'-ENDES
EINES
MONOTERPENSYNTHASE-GENS
.
104
3.3.3.
AMPLIFIZIERUNG
VON
FULL
LENGTH
CDNA
.
106
3.4.
VARIABILITAET
DER
MONOTERPENSYNTHASE-AKTIVITAET
IN
FICHTENNADELN
.
116
3.4.1.
TAG
/
NACHT-VERGLEICH
.
116
3.4.2.
JAHRESZEITLICHE
VARIABILITAET
.
118
3.4.2.1.
DIE
UNTERSUCHUNGSJAHRE
1998
UND
1999
.
119
3.4.2.2.
PROTEINGEHALTE
DER
NADELN
.
122
3.4.2.3.
MONOTERPENSYNTHASE-AKTIVITAET
.
124
3.4.3.
VERGLEICH
DER
MONOTERPENSYNTHASE-AKTIVITAET
MIT
DEM
ENDOGENEN
MONOTERPENGEHALT
.
129
III
3.5.
VARIABILITAET
DER
MONOTERPENSYNTHASE-AKTLVITAET
IN
BLAETTERN
DER
STEINEICHE
.
133
3.5.1.
TAG
/
NACHT
-
VERGLEICH
.
133
3.5.2.
JAHRESZEITLICHE
VARIABILITAET
.
135
3.5.2.1
.
DIE
UNTERSUCHUNGSJAHRE
1998
UND
1999
.
135
3.5.2.2.
PROTEINGEHALTE
DER
BLAETTER
.
138
3.5.2.3.
MONOTERPENSYNTHASE-AKTIVITAET
.
139
3.5.3.
VERGLEICH
DER
MONOTERPENSYNTHASE-AKTIVITAET
MIT
DER
MONOTERPENEMISSION
.
145
4.
DISKUSSION
.
.
_
.147
4.1.
NEUE
METHODE
ZUR
MESSUNG
DER
MONOTERPENSYNTHASE-AKTIVITAET
.
147
4.2.
CHARAKTERISTIKA
DER
MONOTERPENSYNTHASEN
AUS
ACHTE
UND
STEINEICHE
.
149
4.3.
NUKLEOTIDSEQUENZEN
MOEGLICHER
MONOTERPENSYNTHASEN
DER
STEINEICHE
.
152
4.4.
MONOTERPENSYNTHASE-AKTIVITAET
IN
DER
STEINEICHE
.
157
4.5.
MONOTERPENSYNTHASE-AKTIVITAET
IN
DER
FICHTE
.
162
4.6.
BEDEUTUNG
DER
MONOTERPENSYNTHASE-AKTIVITAET
BEI
ACHTE
UND
STEINEICHE
.
166
5.
ZUSAMMENFASSUNG
.170
6.
LITERATUR
.
174
IV |
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| author | Fischbach, Robert J. |
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