"Entwicklung einer innovativen Strategie zur Generierung von Knock-out-Mausmodellen":
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| Format: | Abschlussarbeit Buch |
| Sprache: | German |
| Veröffentlicht: |
Berlin
Mensch & Buch-Verl.
2004
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| adam_text | 1 Einleitung 8
2 Literaturübersicht 9
2.1 Die Labormaus in der biomedizinischen Forschung 9
2.2 Das Tet System 11
2.3 Das modifizierte Tet Repressorsystem 14
2.4 Transkriptionsrepression 16
2.5 Repressormoleküle 17
3 Material und Methoden 23
3.1 Material 23
3.1.1 Chemikalien 23
3.1.2 Verbrauchsmaterial 25
3.1.3 Lösungen, Puffer und Kulturmedien 26
3.1.3.1 Lösungen und Puffer 26
3.1.3.2 Kulturmedien 28
3.1.4 Kits 29
3.1.5 Geräte 30
3.1.6 Software 32
3.1.7 Enzyme 33
3.1.7.1 Restriktionsendonukleasen 33
3.1.7.2 DNA modifizierende Enzyme 33
3.1.8 Synthetische Oligonukleotide 33
3.1.9 Vektoren 35
3.1.9.1 Klonierungsvektoren 3 5
3.1.9.2 Säuger Expressionsvektoren 35
3.1.10 Molekulargewichtsmarker 37
3.1.11 Bakterienstämme 37
3.1.12 Zelllinien 37
3.2 Methoden 38
3.2.1 Präparation von Plasmid DNA aus Bakterienkulturen 38
3.2.1.1 Präparation aus 3 ml Kulturen („Mini Präp ) 38
3.2.1.2 Präparation aus 30 ml/400 ml Kulturen („Midi Prep /„Maxi Prep ) 38
3.2.2 Screening einer genomischen Mauscosmid Bank 39
3.2.3 Reinigung von DNA durch Phenol Chloroform Extraktion 39
3.2.4 Fällen von DNA 40
3.2.5 Bestimmung der DNA Konzentration 40
3.2.6 PCR 40
3.2.7 DNA Sequenzierung 40
3.2.8 Agarosegelelektophorese 41
3.2.9 Präparative Aufreinigung von DNA aus Agarosegelen 41
3.2.10 Restriktionsverdau von DNA 42
3.2.10.1 Analytischer Verdau 42
3.2.10.2 Präparativer Verdau 42
3.2.11 Dephosphorylierung von Vektor DNA 42
3.2.12 Auffüllen von DNA 5 Überhängen 42
3.2.13 Entfernen von DNA 3 Überhängen 43
3.2.14 Ligation von DNA 43
3.2.15 Herstellung kompetenter Bakterien 43
5
3.2.16 Transformation 44
3.2.17 Bestimmung von Proteinkonzentrationen nach Bradford 44
3.2.18 Zellkultur 45
3.2.18.1 Kultivieren von NIH 3T3 und HRL9 Zellen 45
3.2.19 Konservierung lebender Zellen 45
3.2.20 Auftauen von Zellen 46
3.2.21 Vorkultur von HRL9 Zellen bzw. HRL9/TetR (B/E) HDAC 4
Einzelklonen für ihre spätere Behandlung mit Doxycyclin, Trichostatin A und
Mimosin 46
3.2.22 Transfektion von Plasmid DNA in NIH 3T3 und HRL9 Zellen 47
3.2.22.1 Stabile Transfektion mittels Calcium Phosphat Präzipitation 47
3.2.22.2 Transiente Transfektion von NIH 3T3 und HRL 9 Zellen mittels Poly Fect47
3.2.23 Präparation von Zellysaten für die luminometrische Messung und die
Proteinbestimmung 47
3.2.24 Messung der Luciferaseaktivität im Luminometer 48
3.2.25 Präparation von Zellen für die Zellzyklusanalyse im FACS Gerät 49
3.2.26 Durchführung der FACS Messung und Auswertung der Daten 49
4 Ergebnisse 52
4.1 Klonierung der Intermediärvektoren und der Transkriptions repressorkonstrukte 52
4.1.1 Generierung des pCMB 1 hygro Expressionsvektors 52
4.1.2 Einbringen der TetR (B/E) DNA Bindedomäne und
Homodimerisationsoberfläche in pCMB 1 hygro 52
4.1.3 Klonierung des pCMBl hygro TetR (B/E) PIasmids 53
4.2 Herstellung von Tet induzierbaren putativen Transkriptionsrepressoren 55
4.2.1 Klonierung der MeCP2 Transkriptionsrepressionsdomäne (TRD) in
pCBM 1 hygro TetR (B/E) 55
4.2.2 Klonierung der Histondeacetylasen 1, 3 und 4 in pCMB 1 hygro Tet
(B/E) 55 v
4.2.2.1 Klonierung des pCMB 1 hygro TetR (B/E) HDAC 1 Plasmids 56
4.2.2.2 Klonierung des pCMB 1 hygro TetR (B/E) HDAC 3 Plasmids 56
4.2.2.3 Klonierung des pCMB 1 hygro TetR (B/E) HDAC 4 Plasmids 56
4.2.2.4 Klonierung des pCMB 1 hygro TetR (B/E) Dnmt 3a Plasmids 57
4.2.2.5 Klonierung des pCMB 1 hygro TetR (B/E) EED Plasmids 57
4.2.2.6 Klonierung des pCMB 1 hygro TetR (B/E) Sin3A Plasmids 57
4.3 Sequenzierung der hergestellten Repressionskonstrukte am Übergang der TetR
(B/E) cDNA zur jeweiligen Silencermolekül 58
4.4 Generierung des HPRT Transkriptionsresponders 58
4.4.1 Klonierung des pTRE HPRT d2EGFP NEO Intermediärkonstruktes 60
4.4.1.1 Klonierung des pIRESneo( BamHI) Plasmids 60
4.4.1.2 Klonierung des pTRE IRESneo( BamHI) Plasmids 60
4.4.1.3 Klonierung des pTRE d2EGFP IRESneo Plasmids 60
4.4.1.4 Klonierung des HPRT Promoters in das pTRE d2EGFP IRESneo Plasmid60
4.4.1.5 Klonierung des pTRE HPRT d2EGFP NEO 6
4.4.2 Klonierung des pbsIVSIRES LUC pA Plasmids 63
4.4.2.1 Klonierung der IVS DNA in pBlueskript SK(+) 63
4.4.2.2 Klonierung der IRES Luciferase polyA Sequenz in das pbsIVS Plasmid 63
4.4.3 Klonierung des HPRT Responderplasmids aus pTRE HPRT d2EGFP
NEO und pbsIVS IRES LUC pA 63
4.5 Evaluierung des Repressionspotentials der Designerrepressoren mit Hilfe des
HPRT Responders 64
4.6 Exogene Regulierbarkeit des stabil in NIH 3T3 transfizierten HPRT Responders
durch pCMV TetR (B/E) KRAB 66
4.7 Die Luciferaseaktivität der HRL9 Zelllinie wurde durch transiente Transfektion
des pCMB 1 hygro TetR (B/E) HDAC 4 repremiert 69
4.8 Tet Regulierbarkeit von stabil mit dem Repressorexpressionskonstrukt pCMB 1
hygro TetR(B/E) HDAC 4 transfizierten HRL9 Einzelklonen 72
4.9 Aufhebung der Silencingaktivität im HRL9 pCMB 1 hygro TetR (B/E) HDAC 4
Einzelklon 102 durch Behandlung mit dem Histondeacetylasehemmer Trichostatin A
(TSA) 75
4.10 Überprüfung der HDAC 4 induzierten Genrepression im Langzeitversuch 76
4.11 Untersuchung auf eine eventuelle Abhängigkeit zwischen Zellzyklus und der
repressiven Wirkung der Histondeacetylaseaktivität auf den hCMV Minimalpromoter 78
4.12 Untersuchung auf eine eventuelle Abhängigkeit zwischen Zellzyklus und
Transkriptionsaktivation im tripeltransfizierten Einzelklon 102 80
5 Diskussion 83
5.1 Klonierung der Tet Repressormolekule und des TRE Responders 83
5.2 Analyse der Repressoren im transienten Transfektionsessay 84
5.3 Stabile Integration des HPRT Responders 88
5.4 Transkriptionsregulierung in HRL9 Zellen und deren modifizierten Derivaten 90
5.5 Analyse der Repression mit Hilfe des HDAC spezifischen Inhibitors TSA 94
5.6 Langzeitstudie zur epigenetischen Modifikation durch HDAC 4 95
5.7 Expressionsalterierung im Zusammenhang mit dem Zellzyklus 96
6 Zusammenfassung 100
7 Summary: ..Development of an innovative strategy for generation of knock out mouse
modeis 102
8 Literaturverzeichnis 104
9 Danksagung 110
10 Lebenslauf 111
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