Assimilation von Ammonium in Bacillus subtilis:
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2003
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: Inhaltsverzeichnis
Inhaltsverzeichnis
Abkürzungsverzeichnis IV
1. Zusammenfassung 1
2. Einleitung 2
2.1. Die Bedeutung von Stickstoff für mikrobielles Wachstum 2
2.2. Prinzipielle Mechanismen der Ammonium-Assimilation 3
2.2.1. Der GS/GOGAT-Zyklus 3
2.2.2. Die Glutamat-Dehydrogenase 4
2.3. Die Regulation des Stickstoffmetabolismus 5
2.3.1. Stickstoffregulation in Enterobakterien 5
2.3.2. Stickstoffregulation in Gram-positiven Bakterien 7
2.3.2.1. Stickstoffregulation in Corynebacterium glutamicum
und Streptomyces coelicolor 8
2.3.2.2. Stickstoffregulation in Bacillus subtilis 9
2.3.3. Stickstoffregulation in Cyanobakterien 10
2.4. Die Regulatorproteine der Pn-Familie 11
2.4.1. Die Pn-Proteine von E. coli: GlnB und GlnK 12
2.4.2. Pn-Proteine in anderen Organismen: strukturelle und genetische Variationen 13
2.4.3. Das konservierte Genpaar glnKamtB 15
2.5. Ammonium-Aufnahmesysteme 16
2.5.1. Regulation der Ammonium-Aufnahme in £ coli 17
2.5.2. B. subtilis NrgA und NrgB: Ammoniumtransporter und Regulator? 18
2.6. Ziele der Arbeit 19
3. Material und Methoden 20
3.1. Bakterienstämme und Plasmide 20
3.1.1. Bakterienstämme 20
3.1.2. Plasmide 22
3.2. Medien 23
3.2.1. Bakteriennährmedien und fakultative Zusätze 23
3.3. Methoden 26
3.3.1. Allgemeine Methoden 26
Inhaltsverzeichnis
3.3.2. Anzucht von Bakterien 27
Anzucht von B. Subtilis Ammonium-Shock Kulturen 27
3.3.3. Transformation von E. coli 27
3.3.4. Transformation von B. subtilis 2°
Herstellung von kompetenten Zellen 28
Transformation der kompetenten Zellen 28
3.3.5. Präparation und Nachweis von DNA 28
Aufreinigung von Plasmid-DNA über modifizierte Alkali/ SDS Lyse 28
Nachweis und Analyse von Plasmid-DNA in E. coli 29
Isolation von chromosomaler DNA aus B. subtilis 29
DNA-Gelelektrophorese 29
Größenstandards 30
Sequenzierung von DNA 30
Restriktion und Ligation von DNA 31
Dephosphorylierung von DNA 31
Polymerasekettenreaktion (PCR) 32
Puffer und Lösungen für das Arbeiten mit DNA 33
3.3.6. Arbeiten mit Proteinen 34
Zellaufschluß durch Ultraschall 34
Zellaufschluß mit der French Press 34
Denaturierende Proteingelelektrophorese 34
Überexpression und Aufreinigung von Proteinen
mittels Affinitätschromatographie 35
Analytische Überexpressionsreihe 35
Quantitative Überexpression 35
Proteinaufreinigung über Ni2+-NTA Säule 36
Dialyse von Proteinen 36
Präparation von Membranfraktionen 36
Westemblot 37
Präparation von Proteinrohlysaten für die 2D-Gelelektrophorese 38
Lösungen zum Arbeiten mit Proteinen 38
3.3.7. Bestimmung von Enzymaktivitäten 40
Bestimmung der ß-Galaktosidaseaktivität 40
Puffer und Losungen zur Bestimmung der ß-Galaktosidaseaktivität 42
Amylasetest auf Stärkeplatten 42
3.3.8. Messung der Methylammonium-Aufnahme in B. subtilis 43
4. Ergebnisse 45
4.1. Die Funktion von NrgA 45
4.1.1. Konstruktion eines Reporterstammes mit chromosomaler nrgA-lacZ-Fusion. 45
4.1.2. Konstruktion von Reporterstämmen mit «rgAß-Deletion 46
4.1.2.1. Konstruktion einer «rgA-Mutante 46
4.1.2.2. Konstruktion einer nrgB- und nrgAB- Mutante 48
4.1.3. Expression von nrgAB in Abhängigkeit von der Ammoniumkonzentration.... 49
4.1.4. Wachstum von nrgAß-Mutanten in Gegenwart von Ammonium 51
4.1.5. Untersuchung der Ammonium-Aufnahme in Bacillus subtilis 55
Inhaltsverzeichnis in
4.2. Die Funktion von NrgB 57
4.2.1. Konstruktion eines Überexpressionsvektors für NrgB 57
4.2.2. Überexpression und Aufreinigung von B. subtilis (HisJöNrgB 57
4.2.3. Stickstoffabhängige Expression von nrgB in B. subtilis 59
4.2.4. Lokalisation von NrgB in B. subtilis 60
4.2.4.1. Reinheit der Membranfraktionen 60
4.2.4.2. Analyse des Wildtyps 61
4.2.4.3. Einfluß einer nrg/ -Deletion auf die Lokalisation von NrgB 63
4.2.5. Möglicher Einfluß von NrgB auf dieTnrA-Aktivität 64
4.2.6. Vergleichende Proteomanalysen 66
4.2.7. Möglicher Einfluß von NrgB
auf die N-abhängige Regulation der Genexpression 70
4.2.7.1. Konstruktion von Reporterstämmen mit Promotor-/acZ-Fusionen 70
4.2.7.2. Expression der Promotor-ZacZ-Fusionen
in den konstruierten Reporterstämmen 71
5. Diskussion 73
5.1. Der NrgA-vermittelte Ammoniumtransport in Bacilhis subtilis 73
5.1.1. Das Wuchsdefizit einer ß. subtilis nrgA-Mutante 73
5.1.2. Die Funktion von NrgA als (Methyl)ammonium Transporter 75
5.1.3. Erfüllt NrgA weiterführende Aufgaben? 78
5.2. Der potentielle Regulator NrgB 79
5.2.1. Die Lokalisation von NrgB - ein Indiz für seine regulatorische Bedeutung? 79
5.2.2. Reguliert NrgB die NrgA-Aktivität in B. subtilisl 82
5.2.3. NrgB als Regulator der TnrA-Aktivität in B. subtilis ! 85
5.2.4. Beeinflußt NrgB die N-abhängige Expression anderer Gene? 87
5.3. Ausblick 90
6. Literaturverzeichnis 91
7. Anhang 113
7.1. Materialien 113
7.1.1. Chemikalien 113
7.1.2. Hilfsmittel 114
7.1.3. Geräte und Apparaturen 115
7.14. Kommerziell erhältliche Systeme 116
7.1.5. Proteine, Antikörper und Enzyme 117
7.2. Oligonukleotide 118
7.3. Verwendete Internetangebote und Computerprogramme 120
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