Wechselwirkung der HPr-Kinase-Phosphorylase aus Mycoplasma pneumoniae mit niedermolekularen Effektoren:
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2003
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Inhaltsverzeichnis
Inhaltsverzeichnis I
Abkürzungsverzeichnis . IV
1. Zusammenfassung 1
2. Einleitung 2
2.1. Mycoplasma pneumoniae 2
2.2. Die HPr-Kinase/Phosphorylase (HPrK/P) 3
2.2.1. Rolle der HPrK/P bei der Katabolitenrepression 4
2.2.2. Rolle der HPrK/P in Mollicutes 6
23. Struktur der HPrK/P 7
2.3.1. Domänenstruktur der HPrK/P 7
2.3.2. Nukleotid-Bindemotive in der HPrK/P 9
2.3.3. HPrK/P im Komplex mit HPr/HPr(Ser)-P 11
2.4. Aktivität der HPrK/P 12
2.4.1 Regulation der HPrK/P. 12
2A2. Mutationsanalysen der konservierten Bereiche der HPrK/P 13
2.4.3. Der katalytische Mechanismus der Kinase/Phosphorylase-Reaktion 14
IS. Zielsetzung der Arbeit. 16
3. Material and Methoden 17
3.1. BakterienstSmme und Plasmide 17
3.1.1 Bakterienstamme 17
3.1.2 Plasmide 17
3.2. Puffer, Losungen und Medien 19
3.2.1. Bakteriennährmedien 19
23. Methoden 19
3.3.1. Allgemeine Methoden. 19
3.3.2. Anzucht von Bakterien 20
3.3 J. Transformation von E. coli. 20
33.4. Arbeiten mit DNA 21
Aufreinigung von PlasmkJ-DNA Ober modifizierte Alkali/SDS-Lyw 21
Nachweis und Analyse von Plasmid-DNA in E. coli 21
DNA-Gd-EkMrophorcse 21
Sequenzierung von DNA 22
Restriktion und LigUion von DNA 22
Dephospbocyliening von DNA 22
Inhaltsverzeichnis II
Polyroerasckcttenreaklioo (PCR) 23
Ortsgerichtete MuUgenese durch zweistufige PCR 23
Losungen zum Arbeit» mit DNA 25
3.3.5. Arbeiten mit Proteinen 25
Oberexnresskn von Proteinen 25
Zeuauischluss durch Ultraschall 26
Protriniufrcinigung mit der ÄKTA™-Prime 26
Proteinaufreinigung mit Ni^-NTA Spin Cohnnns 27
Proteinaufreinigung mit 5/«p-TactinScpharo«Schwcfira(Uäulcn 27
In vitro Phosphorylierung/Dephosphorylierung von HPr 27
Auficinigung von (H,)HPr-Ser46P 28
Denaturierende Proteingcl-Elektrophorese 29
NativePoryacrylamid-Gelelektrophorese 29
Native PAGE zur Analyse von HPr aus M. pneumoniae. 30
Losungen zum Arbeiten mit Proteinen 30
3.3.7. Fluoreszenzspektroskopische Messungen 33
Losungen fllr die nuoreszenzspekiroskopiseben Messungen 35
4. Ergebnisse 36
4.1. Konstruktion von tryptophan markierten Varianten der HPrK/P 36
4.1.1. Konstruktion derMutantenallele und Überexpressionsplasmide 36
4.1.2. Oberexpression dertryptophanmarkierten Varianten in E. coli. 38
4.1.3. Aufreinigung der Proteine durch Affinitätschromatographie 39
4.1.4. Aktivität der Tryptophan Varianten in vitro. 42
4.2. Fluoreszenzspektroskopische Untersuchung der Tryptophanvarianten 43
4.2.1. Stabilität der Tryptophanvarianten 43
4.2.2. Wechselwirkung der HPrK/P mit Fruktose-1,6-Bisphosphat und ATP 45
43. Stimulation der HPrK/P-AktivitSt durch Fruktose-1,6-Bisphosphat und
anorganisches Phosphat (Pi) 49
4.3.1. EinflussvonFruktose-l,6-BisphosphataufdieATP-Bindung 49
4.3.2. Stimulation der HPr-Phosphorylierung durch Fruktose-1,6-Bisphosphat 50
4.3.3. Einfluss von anorganischem Phosphat auf die ATP-Bindung 53
4.4. Analyse der Fruktose-1,6-Bisphospbat und ATP-Bindeeigenschaften von
HPrK/P-Varianten 55
4.4.1. Konstruktion und Oberexpression der HPrK/P-Varianten 56
4.4.2. Wechselwirkung der HPrK/P-Varianten mit Fruktose-1,6-Bisphosphat 58
4.4.3. ATP-Bindung der HPrK/P-Varianten 59
4.4.4. Einfluss von Fruktose-1,6-Bisphosphat auf die ATP-Bindung der HPrK/P-Varianten. 60
4.4.5. Verdrängung von ATP von der Bindestelle durch Pi in HPrK/P-Varianten 61
Inhaltsverzeichnis III
5. Diskussion 63
5.1. Interaktion niedrigmolekularer Bindungspartner mit der HPrK/P 63
5.1.1. Nukleotid-Bindung an die HPrK/P 63
5.1.2. Fniktose-1,6-Bisphosphat-Bindung an die HPrK/P 65
5.1.3. Bindestellen von anorganischem Phosphat in der HPrK/P 67
5.1.4. Feinabstimmung der Enzymaktivität durch Fruktose-1,6-Bisphosphat? 68
5.2. Mutationsanalyse konservierter Bereiche der HPrK/P 69
5.2.1. Konservierte Aminosäuren im P-Loop-Motiv und ihre Funktion 69
5.2.2. Die Signatursequenz der HPrK/P 73
53. Ausblick. 74
6. Literaturverzeichnis 75
7. Anhang 90
7.1 Materialien 90
7.1.1. Chemikalien 90
7.1.2. Hilfsmittel 90
7.1.3. Geräte und Apparaturen. 91
7.1.4. Kommerziell erhältliche Systeme 92
7.1.5. Proteine und Enzyme 92
7.2. Oligonukleotide 92
73. Verwendete Internetangebote 93
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