Reinigung und Charakterisierung der Cynarosid-7-O-beta-D-Glucosidase aus der Arzneidroge Cynarae folium und Cynara scolymus L.:
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| adam_text | WS? REINIGUNG UND CHARAKTERISIERUNG DER CYNAROSID-7-0-SS-D-GLUCOSIDASE
AUS DER ARZNEIDROGE CYNARAE FOIIUM UND CYNARA SCOLYMUS L. DEN
NATURWISSENSCHAFTLICHEN FAKULTAETEN DER FRIEDRICH-ALEXANDER-UNIVERSITAET
ERLANGEN-NUEMBERG ZUR ERLANGUNG DES DOKTORGRADES VORGELEGT VON BIRGIT
NUESSLEIN AUS SCHESSLITZ INHALTSVERZEICHNIS EINLEITUNG 1 ALLGEMEINES 1
CYNARA SCOLYMUS L.: SYSTEMATIK, BOTANIK, VERBREITUNG UND ANBAU 2
INHALTSSTOFFE 4 CAFFEOYLCHINASAEUREN 4 FLAVONOIDE 6 SESQUITERPENLACTONE 7
SONSTIGE INHALTSSTOFFE 9 PHARMAKOLOGIE UND TOXIKOLOGIE 10
ANTI-DYSPEPTISCHE UND CHOLERETISCHE WIRKUNGEN 10 LIPIDSENKENDE UND
ANTI-ATHEROSKLEROTISCHE WIRKUNGEN 12 HEPATOPROTEKTIVE, ANTI-OXIDATIVE
UND ANTI-INFLAMMATORISCHE WIRKUNGEN 14 VERTRAEGLICHKEIT UND
NEBENWIRKUNGEN 15 ENZYME IN DROGEN 15 0-GLUCOSIDASEN DES PFLANZLICHEN
SEKUNDAERSTOFFWECHSELS 17 PROBLEMSTELLUNG 19 B ERGEBNISSE 20 1 ABBAU
ENDOGENER FLAVONOIDE UND KAFFEESAEURE-DERIVATE IN CYNARAE FOIIUM 20 2
ENZYM-AKTIVITAETEN IN PROTEIN-ROHEXTRAKTEN AUS CYNARA SCOLYMUS L . 21 2.1
VORVERSUCHE MIT DER DROGE CYNARAE FOIIUM 21 2.1.1 ENZYMATISCHES PROFIL
EINES PROTEINEXTRAKTES AUS CYNARAE FOIIUM 21 2.1.2
3-GLUCOSIDASE-AKTIVITAET IN DROGENMUSTERN VERSCHIEDENER HERSTELLER 22
2.1.3 . CHARAKTERISIERUNG DER /3-GLUCOSIDASE-AKTIVITAET IM ROHEXTRAKT AUS
CYNARAE FOIIUM 23 2.1.3.1 REAKTIONSKINETIK 23 2.1.3.2 BESTIMMUNG DES
TEMPERATUR-OPTIMUMS 24 2.1.3.3 BESTIMMUNG DES IDEALEN PUFFERSYSTEMS 24
2.1.4 EINFLUSS VON PROTEASE-INHIBITOREN IM ROHEXTRAKT AUS CYNARAE FOIIUM
24 INHALTSVERZEICHNIS 2.2 ENZYMAKTIVITAET IN FRISCHEN UND GETROCKNETEN
BLAETTERN VON CYNARA SCOLYMUS L. 25 2.2.1 EINFLUSS UNTERSCHIEDLICHER
TROCKNUNGSTEMPERATUREN 25 2.2.2 ENZYMAKTIVITAET IN FRISCHEM UND
GETROCKNETEM BLATTMATERIAL VON CYNARA SCOLYMUS L. CV. GOBBO DI NIZZA
27 2.2.3 POLYPHENOL-OXIDASE-AKTIVITAET IM PROTEIN-ROHEXTRAKT 28 2.3
EXTRAHIERBARKEIT DER 0-GLUCOSIDASE- AKTIVITAET BEI UNTERSCHIEDLICHEN
PH-WERTEN 29 2.4 STABILITAET DER /3-GLUCOSIDASE-AKTIVITAET IM ROHEXTRAKT
30 2.4.1 STABILITAET DER (3-GLUCOSIDASE-AKTIVITAET IM ROHEXTRAKT BEI 4 C
30 2.4.2 STABILITAET DER /S-GLUCOSIDASE-AKTIVITAET IM ROHEXTRAKT AUS
FRISCHEN BLAETTERN VON CYNARA SCOLYMUS L. CV. GOBBO DI NIZZA BEI 37 C
31 3 C7G AUS CYNARAE FOIIUM 33 3.1 REINIGUNG DER C7G AUS CYNARAE FOIIUM
33 3.1.1 FRAKTIONIERTE AMMONIUMSULFAT-FAELLUNG 33 3.1.2
SAEULENCHROMATOGRAPHISCHE REINIGUNG 35 3.1.2.1 HYDROPHOBE
INTERAKTIONSCHROMATOGRAPHIE AN PHENYLSEPHAROSE 6 FF 35 3.1.2.2
ANIONENAUSTAUSCH-CHROMATOGRAPHIE AN SOURCE 30Q 36 3.1.2.3 GELFILTRATION
AN SUPERDEX 200 PG 37 3.1.3 REINIGUNGSBILANZ 38 3.1.4 ALTERNATIVE
REINIGUNGSSCHRITTE 40 3.1.4.1 GELFILTRATION AN SEPHACRYL S-300 HR 40
3.1.4.2 ANIONENAUSTAUSCH-CHROMATOGRAPHIE AN RESOURCE Q 42 3.2 MOLEKULARE
EIGENSCHAFTEN DER C7G AUS CYNARAE FOIIUM 43 3.2.1 CHROMATOFOKUSSIERUNG
AN MONO P 43 3.2.2 SDS-POLYACRYLAMID-GELELEKTROPHORESE 44 3.2.2.1
SDS-PAGE UNTER NICHT-REDUZIERENDEN BEDINGUNGEN 44 3.2.2.2 SDS-PAGE UNTER
REDUZIERENDEN BEDINGUNGEN 47 3.2.3 KOHLENHYDRATANTEIL DER C7G 48 3.2.3.1
BESTIMMUNG DES KOHLENHYDRATGEHALTS MITTELS RESORCIN-SCHWEFELSAEURE-TEST
48 3.2.3.2 PAS-FAERBUNG 49 3.2.3.3 DEGLYCOSYLIERUNG 51 INHALTSVERZEICHNIS
3.2.4 INKUBATION DER C7G MIT HYDROLASEN 52 3.2.4.1 INKUBATION MIT
INULINASE 52 3.2.4.2 INKUBATION MIT TRYPSIN 53 3.2.4.3 INKUBATION MIT
PRONASE 54 3.2.5 NACHWEIS DER /S-GLUCOSIDASE-AKTIVITAET NACH SDS-PAGE 55
3.3 IMMUNOLOGISCHE UNTERSUCHUNG DER C7G 56 3.3.1 DOT-BLOT 57 3.3.2
WESTEM-BLOT 58 3.4 KINETISCHE CHARAKTERISIERUNG DER C7G 61 3.4.1
TEMPERATUR-OPTIMUM UND AKTIVIERUNGSENERGIE 61 3.4.2 PH-OPTIMUM 62 3.4.3
EINFLUSS VERSCHIEDENER PUFFERSYSTEME AUF DIE AKTIVITAET DER C7G 63 3.4.4
KINETISCHE KONSTANTEN UND SUBSTRATSPEZIFITAET 64 3.4.4.1 FLAVONOID- UND
CUMARINGLYCOSIDE 64 3.4.4.2 NITROPHENYLGLYCOSIDE 67 4 C7G AUS CYNARA
SCOLYMUS L. CV. GOBBO DI NIZZA 68 4.1 REINIGUNG DER C7G AUS CYNARA
SCOLYMUS L. CV. GOBBO DI NIZZA 68 4.1.1 FRAKTIONIERTE
AMMONIUMSULFAT-FAELLUNG 68 4.1.2 SAEULENCHROMATOGRAPHISCHE REINIGUNG 70
4.1.2.1 HYDROPHOBE INTERAKTIONSCHROMATOGRAPHIE AN PHENYLSEPHAROSE 6 FF
70 4.1.2.2 ANIONENAUSTAUSCH-CHROMATOGRAPHIE AN SOURCE 30Q 71 4.1.2.3
GELFILTRATION AN SUPERDEX 200 PG 72 4.1.3 REINIGUNGSBILANZ 73 4.2
MOLEKULARE EIGENSCHAFTEN DER C7G AUS CYNARA SCOLYMUS L. CV. GOBBO DI
NIZZA 74 4.2.1 CHROMATOFOKUSSIERUNG AN MONO P 74 4.2.2
SDS-POLYACRYLAMID-GELELEKTROPHORESE 75 4.2.3 NACHWEIS DER
0-GLUCOSIDASE-AKTIVITAET NACH SDS-PAGE 77 4.2.4 PAS-FAERBUNG 79 4.2.5
PARTIELLE SEQUENZIERUNG UND SEQUENZ-HOMOLOGIEN DER C7G AUS CYNARA
SCOLYMUS L. CV. GOBBO DI NIZZA 79 FFL INHALTSVERZEICHNIS 4.3
TEILREINIGUNG DER C7G AUS GETROCKNETEN BLAETTERN VON CYNARA SCOLYMUS L.
CV. GOBBO DI NIZZA 82 4.3.1 FRAKTIONIERTE AMMONIUMSULFAT-FAELLUNG 82
4.3.2 SAEULENCHROMATOGRAPHISCHE REINIGUNG 83 4.3.2.1 HYDROPHOBE
INTERAKTIONSCHROMATOGRAPHIE AN PHENYLSEPHAROSE 6 FF 83 4.3.2.2
ANIONENAUSTAUSCH-CHROMATOGRAPHIE AN SOURCE 30Q 84 4.3.2.3 GELFILTRATION
AN SUPERDEX 200 PG 85 4.3.3 REINIGUNGSBILANZ 86 4.3.4
CHROMATOFOKUSSIERUNG AN MONO P 86 4.3.5
SDS-POLYACRYLAMID-GELELEKTROPHORESE 87 C DISKUSSION 89 D MATERIAL UND
METHODEN 114 1 PFLANZENMATERIAL 114 1.1 CYNARAE FOIIUM 114 1.2 CYNARA
SCOLYMUS L. 114 2 INKUBATION VON DROGENPULVER 115 3 GEWINNUNG DER
PROTEIN-ROHEXTRAKTE 115 3.1 EXTRAKTION AUS CYNARAE FOIIUM 115 3.2
EXTRAKTION AUS CYNARA SCOLYMUS L. CV. GOBBO DI NIZZA 115 4 ENZYMTESTS
116 4.1 FLAVONOIDGLYCOSIDE UND ESCULIN 116 4.2 NITROPHENYLGLYCOSIDE 116
4.3 BESTIMMUNG DER POLYPHENOL-OXIDASE 117 4.4 INKUBATION DER C7G MIT
HYDROLASEN 117 4.4.1 INKUBATION MIT INULINASE 117 4.4.2 INKUBATION MIT
TRYPSIN 118 4.4.3 INKUBATION MIT PRONASE 118 4.5 BESTIMMUNG DIVERSER
ENZYMAKTIVITAETEN MITTELS API ZYM-SYSTEM 118 IV INHALTSVERZEICHNIS 5
ENTSALZEN UND EINENGEN VON PROTEINLOESUNGEN 119 5.1
GELPERMEATIONSCHROMATOGRAPHIE 119 5.2 DIALYSE 119 5.3 ULTRAFILTRATION
119 6 FRAKTIONIERTE AMMONIUMSULFAT-FAELLUNG 12 0 7 ANALYTIK 120 7.1
DUENNSCHICHTCHROMATOGRAPHIE (DC) 120 7.2
HOCHLEISTUNGSFLUESIGKEITSCHROMATOGRAPHIE (HPLC) 120 7.3
RESORCIN-SCHWEFELSAEURE-TEST 121 7.4 PROTEINBESTIMMUNG 122 7.5
FAST-PROTEIN-LIQUID-CHROMATOGRAPHIE (FPLC) 122 7.5.1 HYDROPHOBE
INTERAKTIONSCHROMATOGRAPHIE (HIC) 123 7.5.1.1 PHENYLSEPHAROSE 6 FF HIGH
SUB 123 7.5.2 IONENAUSTAUSCH-CHROMATOGRAPHIE (IEC) 124 7.5.2.1 SOURCE30Q
124 7.5.2.2 RESOURCEQ 125 7.5.3 CHROMATOFOKUSSIERUNG 126 7.5.3.1 MONOP
126 7.5.4 GELFILTRATION 127 7.5.4.1 SUPERDEX 200 PG 127 7.5.4.2
SEPHACRYL S-300 HR 128 8 GELELEKTROPHORESE 128 8.1 GELZUSAMMENSETZUNG
UND PROBENVORBEREITUNG 128 8.2 FAERBEMETHODEN 130 8.2.1 COOMASSIE-FAERBUNG
130 8.2.2 SILBERFAERBUNG 130 8.2.3 PAS-FAERBUNG 131 8.2.4 BESTIMMUNG DER
C7G-AKTIVITAET NACH SDS-PAGE (ZYMOGRAMM) 132 8.3 BESTIMMUNG DES
MOLEKULARGEWICHTS 132 8.4 BESTIMMUNG DES KOHLENHYDRATANTEILS
(DEGLYCOSYLIERUNG) 133 V INHALTSVERZEICHNIS 9 IMMUNOLOGISCHE
NACHWEISVERFAHREN 9.1 DOT-BLOT 9.1.1 LOESUNGEN UND PUFFER 9.1.2
VERWENDETE IMMUNSEREN UND ANTIKOERPER 9.1.3 VORGEHENSWEISE 9.2
WESTERN-BLOT 9.2.1 LOESUNGEN UND PUFFER 9.2.2 VERWENDETE ANTIKOERPER 9.2.3
VORGEHENSWEISE 9.2.4 BESTIMMUNG DES MOLEKULARGEWICHTS DER ERKANNTEN
ANTIGENE 10 PROTEIN-SEQUENZIERUNG 11 VERWENDETE CHEMIKALIEN UND
VERBRAUCHSMATERIAL 11.1 CHEMIKALIEN 11.2 VERBRAUCHSMATERIAL 11.3 PUFFER
12 GERAETE E ZUSAMMENFASSUNG F LITERATURVERZEICHNIS VI
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