Klonierung, Expression und Charakterisierung der Lipidtransferprotein-Genfamilie wax9 aus Brassica oleracea:
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| adam_text | INSTITUT FUER PFLANZENPHYSIOLOEGIE UND MIKROBIOLOGIE; FREIE UNIVERSITAET
BERLIN KLONIERUNG, EXPRESSION UND CHARAKTERISIERUNG DER
LIPIDTRANSFERPROTEIN- GENFAMILIE WAX9 AUS BR.ASSICA OLERACEA
Z-SJVZ*-:? * -- * *: INAUGURALDISSERTATION ZUR ERLANGUNG DES
NATURWISSENSCHAFTLICHEN DOKTORGRADES AM FACHBEREICH
BIOLOGIE-CHEMIE-PHARMAZIE DER FREIEN UNIVERSITAET BERLIN VORGELEGT VON
SILKE MARTINA SCHILLING AUS BERLIN BERLIN 2003 INHALTSVERZEICHNIS
INHALTSVERZEICHNIS INHALTSVERZEICHNIS VERZEICHNIS DER VERWENDETEN
ABKUERZUNGEN 1. EINLEITUNG 1 1.1. KAELTESTRESS 1 1.1.1.
MEMBRANVERAENDERUNGEN BEI NIEDRIGEN TEMPERATUREN 2 1.1.2.
GEFRIERSCHUTZSTOFFE 2 1.1.3. KRYOPROTEKTIVE PROTEINE 3 1.2.
KRYOPROTEKTIN AUS BRASSICA OLERACEA 5 1.2.1. MECHANISMUS DER AKTIVITAET
VON KRYOPROTEKTIN 5 1.3. LIPIDTRANSFERPROTEINE 6 1.3.1. FUNKTION DER
LIPIDTRANSFERPROTEINE 6 1.4. ZIELSETZUNG 8 2. MATERIAL UND METHODEN 9
2.1. MATERIAL 9 2.1.1. PFLANZENMATERIAL 9 2.1.1.1. SPINATPFLANZEN 9
2.1.1.2. WINTERGERSTE 9 2.1.1.3. WIRSINGKOHL 9 2.1.2. BAKTERIENSTAEMME 9
2.1.3. VERWENDETE GENE 10 2.1.4. VEKTOREN 10 2.1.5. OLIGONUKLEOTIDE 10
2.1.6. VERWENDETE DNA-SONDEN 12 2.1.7. ANTIKOERPER 12 2.1.8. CHEMIKALIEN,
RADIOCHEMIKALIEN 12 2.1.8.1. CHEMIKALIEN 12 2.1.8.2. RADIOCHEMIKALIEN 13
2.1.9. GERAETE UND APPARATUREN 13 2.2. METHODEN . 15 2.2.1.
PFLANZENANZUCHT 15 2.2.1.1. SPINATPFLANZEN 15 INHALTSVERZEICHNIS
2.2.1.2. WINTERGERSTE 15 2.2.1.3. WIRSINGKOHL 15 2.2.2. STRESSBEHANDLUNG
DES PFLANZENMATERIALS 15 2.2.3. KLONIERUNG VON DNA-FRAGMENTEN 17
2.2.3.1. DNA-LIGATION 17 2.2.3.2. TRANSFORMATION VON E. COLI 18 2.2.3.3.
SELEKTION REKOMBINANTER BAKTERIENKLONE 18 2.2.3.4. PRAEPARATION
KOMPETENTER BAKTERIENZELLEN (HANAHAN, 1995) 19 2.2.4. PRAEPARATION VON
DNA 19 2.2.4.1. ISOLIERUNG VON GESAMT-NUKLEINSAEUREN AUS PFLANZEN
(CTAB-METHODE, DOYLE AND DOYLE, 1987) 19 2.2.4.2. MINIPRAEPARATION VON
PLASMID-DNA (NACH BIRNBOIM-DOLY, 1979) 20 2.2.4.3. MIDIPRAEPARATION VON
PLASMID-DNA 21 2.2.4.4. RESTRIKTIONSSPALTUNG VON DNA 21 2.2.5.
PRAEPARATION VON DNA-FRAGMENTEN 21 2.2.5.1. DNA-AUFTRENNUNG/HORIZONTALE
AGAROSE-GELELEKTROPHORESE 21 2.2.5.2. GEL-ELUTION 22 2.2.6.
PCR-AMPLIFIKATION VON DNA 22 2.2.7. RT-PCR 23 2.2.8. BESTIMMUNG DER
DNA/RNA-KONZENTRATION 23 2.2.9. RNA-ISOLIERUNG 24 2.2.10. DENATURIERENDE
FORMALDEHYD-AGAROSEGELELEKTROPHORESE 24 2.2.11. NUKLEINSAEURE-BLOTTING 25
2.2.12. NORTHERN-HYBRIDISIERUNG 25 2.2.13. SOUTHERN-HYBRIDISIERUNG 26
2.2.14. MARKIERUNG VON DNA-SONDEN 27 2.2.15. UNTERSUCHUNGEN ZUR
EXPRESSION REKOMBINANTER PROTEINE IN E. COLI 27 2.2.15.1. INDUKTION DER
REKOMBINANTEN PROTEINE 27 2.2.15.2. ISOLATION VON GESAMTPROTEIN AUS E.
COLI 28 2.2.15.3. PRAEPARATION VON REKOMBINANTEM PROTEIN AUS E. COLI 28
2.2.15.4. ENTEROKINASEBEHANDLUNG DER FUSIONSPROTEINE 29 2.2.16.
ISOLATION VON GESAMTPROTEIN AUS PFLANZEN 30 2.2.17. ANALYSE VON
PROTEINEN 31 INHALTSVERZEICHNIS 2.2.17.1. PROTEINBESTIMMUNG NACH
BRADFORD (1976) 31 2.2.17.2. SDS-PROTEINGELELEKTROPHORESE 31 2.2.17.2.1.
SDS-PROTEINGELELEKTROPHORESE NACH LAEMMLI (1970) 31 2.2.17.2.2.
SDS-PROTEINGELELEKTROPHORESE NACH SCHAEGGER UND VON JAGOW (1987) 32
2.2.17.2.3. COOMASSIE-FAERBUNG 33 2.2.17.2.4. SILBERFAERBUNG 344
2.2.17.2.5. TRANSFER DER PROTEINE AUF CELLULOSENITRATMEMBRANEN 34
2.2.17.2.6. WESTERNHYBRIDISIERUNG 34 2.2.18. FROSTSCHUTZTEST (HINCHA AND
SCHMITT, 1992A) 35 2.2.18.1. THYLAKOIDISOLATION AUS CHLOROPLASTEN
UNGEHAERTETER SPINATPFLANZEN 35 2.2.18.2. CHLOROPHYLLBESTIMMUNG NACH
ARNON (1949) 35 2.2.18.3. PROTEINVORBEREITUNG 36 2.2.18.4. DURCHFUEHRUNG
DES FROSTSCHUTZTESTS 36 2.2.18.5. VOLUMETRISCHER TEST 36 2.2.19.
LIPIDTRANSFERTEST 37 2.2.20. DURCHFUEHRUNG DER MARKIERUNG MIT KOLLOIDALEM
GOLD 38 2.2.20.1. VORBEREITUNG DES BLATTMATERIALS 38 2.2.20.2.
GOLDMARKIERUNG DER PROTEINE 38 2.2.20.3. MARKIERUNGSREAKTION 399 2.2.21.
IN P/ANFA-TRANSFORMATION VON ARABIDOPSIS THALIANA 39 2.2.21.1.
TRANSFORMATION VON AGROBACTERIUM TUMEFACIENS 39 2.2.21.2 ANZUCHT VON
ARABIDOPSIS THALIANA (ERDKULTUR) 40 2.2.21.3. TRANSFORMATION VON
ARABIDOPSIS THALIANA 40 2.2.21.4. STERILISATION DER SAMEN 411 2.2.21.5.
SELEKTION DER TRANSFORMIERTEN PFLANZEN 41 3. ERGEBNISSE 43 3.1.
KLONIERUNG UND EXPRESSION DER WA^P-GENE 43 3.1.1. AMPLIFIKATION DER
WAX9-GENE 43 3.1.2. DAS BAKTERIELLE EXPRESSIONSSYSTEM 44 3.1.3. DIE
EXPRESSION DER WAX9-PROTEINE 46 3.1.3.1. OPTIMIERUNG DER EXPRESSION DER
WAX9-PROTEINE 48 3.1.3.1.1. OPTIMIERUNG DER INDUKTIONSTEMPERATUR 48
3.1.3.1.2. OPTIMIERUNG DER IPTG-KONZENTRATION 48 INHALTSVERZEICHNIS 3.2.
KONZENTRIERUNG UND OPTIMIERUNG DER AUSBEUTE DER WAX9-PROTEINE 49 3.2.1.
CI8-KARTUSCHEN 49 3.2.2. MICROSEP 3K OMEGA-KONZENTRATOREN 50 3.2.3.
PROTEASEHEMMER 51 3.2.4. ZUSATZ VON BSA BEI DER ENTEROKINASEBEHANDLUNG
51 3.2.5. REAKTIONSGEFAESSE 51 3.2.6. OPTIMIERUNG DER
ENTEROKINASEBEHANDLUNG 52 3.2.6.1. ZEITABHAENGIGKEIT DER
ENTEROKINASEREAKTION 52 3.2.6.2. OPTIMIERUNG DES SCHNEIDEPUFFERS FUER DIE
ENTEROKINASEBEHANDLUNG 53 3.2.7. PRAEZIPITATION DER WAX9-PROTEINE 53
3.2.7.1. LOESUNGSVERSUCHE DER PRAEZIPITIERTEN, REKOMBINANTEN WAX9-PROTEINE
54 3.2.7.2. ENTEROKINASEBEHANDLUNG IN ANWESENHEIT VON 2 M HARNSTOFF 55
3.2.8. EINSATZ VON REDUKTIONSMITTELN BEI DER PROBENVORBEREITUNG FUER DIE
PROTEINGELELEKTROPHORESE 56 3.3. MODIFIKATION DER AKTIVITAETSTESTS 57
3.3.1. MODIFIKATION DES FROSTSCHUTZTESTS 57 3.3.2. MODIFIKATION DES
LIPIDTRANSFERTESTS 57 3.4. AKTIVITAETSTESTS 58 3.4.1. FROSTSCHUTZTEST 58
3.4.2. LIPIDTRANSFERTEST 58 3.5. BINDUNGSVERSUCHE AN THYLAKOIDE 59 3.6.
CHARAKTERISIERUNG DER EXPRESSION DER WOXP-GENE 61 3.6.1. AUSWAHL
SPEZIFISCHER SONDEN FUER DIE NORTHERNANALYSE 61 3.6.2. VERGLEICH DER
TRANSKRIPTIONSMUSTER DER WAXP-GENE IN BRASSICA OLERACEA DURCH
NORTHERN-HYBRIDISIERUNG 62 3.6.2.1. VERGLEICH DER TRANSKRIPTIONSMUSTER
DER WAX9-GENE UNTER STRESSBEDINGUNGEN MITTELS FLOATING 63 3.6.2.1.1.
ALLGEMEINE STRESSBEHANDLUNGEN 63 3.6.2.1.2. SCHWERMETALLBEHANDLUNG 65
3.6.3. VERGLEICH DER TRANSKRIPTIONSMUSTER DER WAX9-GENE UNTER
STRESSBEDINGUNGEN BEI BEHANDLUNG DER GANZEN PFLANZE 67 3.6.3.1. KAELTE-UND
TROCKENSTRESS 67 3.7. MARKIERUNGEN MIT KOLLOIDALEM GOLD 69
INHALTSVERZEICHNIS 3.8. UNTERSUCHUNGEN DER TRANSGENEN ARABIDOPSIS
THALIANA 71 3.8.1. SELEKTION VON TRANSGENEN ARABIDOPSIS THALIANA 71 3.9.
CHARAKTERISIERUNG DER WAXP-GENFAMILIE AUS BRASSICA OLERACEA 73 3.9.1.
VERGLEICH DER NUKLEOTIDSEQUENZEN DER WAXP-GENE 73 3.9.2. VERGLEICH DER
ABGELEITETEN AMINOSAEURESEQUENZEN DER URAP-GENE 75 3.9.3. ANALYSE DER
HYDROPHOBIZITAET DER WAX9-PROTEINE 76 3.10. SEQUENZANALYSE
UNTERSCHIEDLICHER LIPIDTRANSFERPROTEINE 78 3.10.1. SEQUENZVERGLEICH
UNTERSCHIEDLICHER LIPIDTRANSFERPROTEINE 78 3.10.2. STAMMBAUMANALYSE 79
4. DISKUSSION 82 4.1. STRATEGIEN ZUR KLONIERUNG UND EXPRESSION DER
WAXP-GENE 82 4.1.1. HERSTELLUNG DER EXPRESSIONSKONSTRUKTE 82 4.1.2.
AUSWAHL DES BAKTERIELLEN EXPRESSIONSSYSTEMS 83 4.2. OPTIMIERUNG DER
EXPRESSION DER WAX9-PROTEINE 83 4.3. OPTIMIERUNG DER AUSBEUTE AN NATIVEM
WAX9-PROTEIN 84 4.4. PRAEZIPITATION DER WAX9-PROTEINE 86 4.5.
AKTIVITAETSTESTS 88 4.5.1. MODIFIKATIONEN DER AKTIVITAETSTESTS 88 4.5.2.
ERGEBNISSE DER AKTIVITAETSTESTS 88 4.6. BINDUNGSVERSUCHE AN
THYLAKOIDMEMBRANEN 90 4.7. ANALYSE DER TRANSKRIPTIONSMUSTER DER
WAXP-GENE 90 4.8. ANALYSE DER MARKIERUNGEN MIT KOLLOIDALEM GOLD 95 4.9.
ANALYSE DER TRANSGENEN ARABIDOPSIS THALIANA-PFIANZEN 96 4.10.
SEQUENZANALYSEN 96 4.10.1. ANALYSE DER NUKLEOTIDSEQUENZEN 96 4.10.2.
ANALYSE DER ABGELEITETEN AMINOSAEURESEQUENZEN 97 4.10.3. STRUKTUR DER
WAX9-PROTEINE 98 4.10.4. SCHLUSSFOLGERUNGEN AUS DEN HYDROPATHIEANALYSEN
101 4.10.5. SCHLUSSFOLGERUNGEN AUS DER STAMMBAUMANALYSE 102 5.
ZUSAMMENFASSUNG 104 6. LITERATURVERZEICHNIS 106
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