Entwicklung von GM-CSF-produzierenden EBV-Vektoren für die Immuntherapie der B-CLL:
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| Veröffentlicht: |
2003
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1.
EINLEITUNG.
.
6
1.1.
GM-CSF
ZUR
GENTHERAPIE
VON
LYMPHOMEN
.
6
1.2.
DENDRITISCHE
ZELLEN
ALS
HAUPTMEDIATOREN
DER
IMMUNANTWORT
.
8
1.2.1.
HERKUNFT
UND
DIFFERENZIERUNG
DER
DENDRITISCHEN
ZELLEN
.
8
1.2.2.
FUNKTIONEN
DER
DENDRITISCHEN
ZELLEN
.
8
1.3.
THERAPEUTISCHE
MOEGLICHKEITEN
BEI
DER
CHRONISCHEN
LYMPHATISCHEN
LEUKAEMIE
(CLL)
.
11
1.4.
DAS
EPSTEIN-BARR
VIRUS
.
13
1.4.1.
LATENZ
UND
LYTISCHE
PHASE
VON
EBV
.
13
1.4.2.
WICHTIGE
ONKOGENE
UND
REGULATOREN
VON
EBV
.
14
1.5
GEN
VEKTOREN
.
16
1.5.1.
VERSCHIEDENE
VIRALE
VEKTOREN
.
16
1.5.2.
EBV-VEKTOREN
.
18
1.6.
AUFGABENSTELLUNG
.
19
2.
MATERIAL
.
21
2.1.
ANTIKOERPER
_
21
2.2.
BAKTERIEN
.
22
2.3.
OLIGONUKLEOTIDE
.
22
2.4.
PLASMIDE
.
23
2.5.
ZELLLINIEN
.
24
2.6.
CHEMIKALIEN,
ENZYME,
GERAETE
UND
SONSTIGES
.
25
3.
METHODEN
.
29
3.1.
BAKTERIENKULTUR
.
29
3.1.1.
VERMEHRUNG
UND
AUFBEWAHRUNG
VON
BAKTERIEN
.
29
3.1.2.
TRANSFORMATION
UND
ELEKTROPORATION
VON
E.
COLI
.
29
3.1.3.
FERMENTATION
VON
E.
COLI
.
30
3.2.
EUKARYONTISCHE
ZELLKULTUR
.
31
3.2.1
ZELIKULTURBEDINGUNGEN
.
31
3.2.2
AUFBEWAHRUNG
VON
ZELLEN
.
32
3.2.3
PRAEPARATION
MYELO-MONOZYTAERER
VORLAEUFERZELLEN
AUS
PERIPHEREM
BLUT UND
REIFUNG
ZU
DENDRITISCHEN
ZELLEN
.
32
3.2.4.
KULTIVIERUNG
UND
STIMULIERUNG
SPEZIFISCHER
T-ZELL-KLONE
.33
3.2.5.
PRAEPARATION
PRIMAERER
B-ZELLEN
.
34
3.2.6.
STABILE
TRANSFEKTION
VON
ZELLEN
UND
SELEKTION
DER
ZELLKLONE
MIT
HYGROMYCIN
.
34
3.2.7.
TRANSIENTE
TRANSFEKTION
VON
ZELLEN
MIT
GM-CSF-EXPRESSIONSPLASMIDEN
UND
BLOCKIERUNG
DES
INTRAZELLULAEREN
TRANSPORTS
DURCH
BREFELDIN
A
.
35
3.2.8.
ELEKTROPORATION
EUKARYONTISCHER
ZELLEN
.
35
3.2.9.
PRODUKTION
INFEKTIOESER
VIRUSPARTIKEL
UND
TITERBESTIMMUNG
.
36
3.2.10.
KONZENTRATION
VON
VIRUSPRAEPARATIONEN
.
36
3.2.11.
INFEKTION
VON
RAJI-ZELLEN
UND
PRIMAEREN
B-ZELLEN
MIT
MAXI-EBV-VEKTOREN
ZUR
BESTIMMUNG
DER
GM-CSF-SEKRETION
.
?
.
37
3.2.12.
MESSUNG
DER
MTT-KONVERSION
EINER
GM-CSF-ABHAENGIGEN
ZELLLINIE
.
37
3.3.
DNA-ARBEITSTECHNIKEN
.
38
3.3.1.
REKOMBINANTE
PLASMIDE
.
41
3.3.2.
EXTRAKTION
ZELLULAERER
DNA
AUS
EUKARYONTISCHEN
ZELLEN
.
41
3.3.3.
SCHNELLAUFREINIGUNG
VON
PLASMIDEN
MIT
EINER
GROESSE
VON
BIS
ZU
30KB
.
41
3.3.4.
PRAEPARATIVE
PLASMIDREINIGUNG
.
.
.
41
3.3.5.
PRAEPARATION
VON
EBV-PLASMID-DNA
AUS
E.
COLI
.
42
3.3.6.
HOMOLOGE
REKOMBINATION
IN
E.
COLI
ZUR
KONSTRUKTION
VON
MAXI-EBV-MUTANTEN
.
42
3.3.7.
SOUTHERN-BLOT-HYBRIDISIERUNG
.
43
3.3.8.
RADIOAKTIVE
MARKIERUNG
VON
DNA
.
44
3.3.9.
PCR-ANALYSEN.
44
3.4.
PROTEINNACHWEISTECHNIKEN
.
47
3.4.1.
IMMUNFLUORESZENZANALYSEN
.45
3.4.2.
DURCHFLUSSZYTOMETRIE
.
45
3.4.3.
IMMUNOBLOT-ANALYSE
.
46
3.4.4.
GM-CSF-ELISA
.
47
4.
ERGEBNISSE
.
49
4.1.
HERSTELLUNG
DER
REKOMBINANTEN
EBV-VEKTOREN
.
50
4.1.1.
HOMOLOGE
REKOMBINATION
IN
E.
COLI
BJ5183
.
51
4.1.2.
HOMOLOGE
REKOMBINATION
IN
E.
COFT'DHIOB
.52
4.1.3.
.CHROMOSOMAL
BUILDING
'
.54
4.1.4.
ETABLIERUNG
DER
DREIFACHDELETIONSMUTANTE
ALS
SICHEREN
EBV-GENVEKTOR
.56
4.2.
EINFUEHRUNG
DES
TRANSGENS
GM-CSF
IN
DIE
EBV-VEKTOREN
.
57
4.2.1.
KLONIERUNG
DER
EXPRESSIONSKASSETTEN
MIT
GM-CSF
UNTER
DER
KONTROLLE
VERSCHIEDENER
PROMOTOREN
.
57
4.2.2.
TRANSFER
DER
EXPRESSIONSKASSETTEN
IN
DIE
DREIFACHDELETIONSMUTANTE
.
63
4.3.
HERSTELLUNG
VON
MAXI-EBV-VEKTOREN
.
68
4.3.1.
ETABLIERUNG
STABILER
MAXI-EBV-PRODUZIERENDER
HEK293-ZELLLINIEN
.
68
4.3.2.
INDUKTION
DES
LYTISCHEN
ZYKLUS
UND
BESTIMMUNG
DES VIRUSTITERS
.
68
4.3.3.
HERSTELLUNG
KONZENTRIERTER
MAXI-EBV-PRAEPARATIONEN
.
71
4.4.
TRANSDUKTION
VERSCHIEDENER
B-LYMPHOZYTEN
MIT
DEN
GM-CSF-VEKTOREN
.
72
4.4.1.
EINFLUSS
DER
(EBNA2,
LMP1
,
BZLF1-)
DELETIONEN
AUF
DIE
INFIZIERBARKEIT
VON
B
LYMPHOZYTEN
.
72
4.4.2.
TRANSDUKTION
VON
B-ZELLLLNIEN
.
73
4.4.3.
TRANSDUKTION
VON
B-CLL-ZELLEN
.
76
4.5.
BIOLOGISCHE
WIRKUNG
DES
NACH
GENTRANSFER
SEZERNIERTEN
GM-CSF
.
81
4.5.1.
PROLIFERATION
EINER
GM-CSF-ABHAENGIGEN
ZELLLINIE
.
81
4.5.2.
ETABLIERUNG
EINES
REIFUNGSPROTOKOLLS
FUER
DC
AUS
MONOZYTAEREN
VORLAEUFERN
MITTELS
GM-CSF
UND
IL-4
.
83
4.5.3.
GEWINNUNG
VON
GM-CSF-HALTIGEN
UEBERSTAENDEN
AUS
RAJI-INFEKTIONEN
.
84
4.5.4.
REIFUNG
VON
DC
AUS
MONOZYTAEREN
VORLAEUFERN
DES
PERIPHEREN
BLUTS
MIT
HILFE
DES
NACH
GENTRANSFER
IN
B-ZELLEN
SEZERNIERTEN
GM-CSF
.
86
4.5.3.1.
NACHWEIS
DER
DC-TYPISCHEN
OBERFLAECHENMARKER
.
86
4.5.3.2.
AKTIVIERUNG
SPEZIFISCHER
CD4-POSITIVERT-ZELL-KLONE
DURCH
EXOGEN
BELADENE
DC,
DIE
MIT
-NACH
GENTRANSFER
SEZERNIERTEM
GM-CSF
KULTIVIERT
WURDEN
.
88
5.
DISKUSSION
.
94
5.1.
GENVEKTOREN
AUF
DER
BASIS
VON
MAXI-EBVS
.
94
5.1.1.
SICHERHEITSKRITERIEN
ALS
ENTSCHEIDENDE
PARAMETER
.
94
5.1.2.
EXPRESSION
DES
TRANSGENS
.
95
5.2.
TRANSDUKTION
VON
B-ZELLEN
MIT
DEN
MAXI-EBV-GENVEKTOREN
.
97
5.3.
FUNKTIONEN
DES
GM-CSF
.
99
5.4.
HYPOTHESE
ZUR
WIRKUNG
DES
GM-CSF
IM
RAHMEN
VON
B-CLL-ZELL-VAKZINEN
.
103
5.5.
AUSBLICK:
ANWENDUNG
DER
EBV-GENVEKTOREN
IN
DER
IMMUN
UND
GENTHERAPIE?
.
104
6.
ZUSAMMENFASSUNG
.
107
7.
ABKUERZUNGEN
.
109
8.
LITERATUR
.111
ANHANG.
.
123
LEBENSLAUF
.
130
DANKSAGUNG
.
131 |
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