Chemotaxis von Seeigel-Spermien: kinetische Messungen intrazellulärer Botenstoffe
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Jülich
Forschungszentrum, Zentralbibliothek
2003
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I
INHALTSVERZEICHNIS
I
II
ABKUERZUNGSVERZEICHNIS
V
1
EINLEITUNG
1
1.1
STADIEN
DER
EIZELLBEFRUCHTUNG
1
1.2
CHEMOTAXIS
VON
SEEIGEL-SPERMIEN
2
1.3
ZIELSETZUNG
7
2
MATERIAL
UND
METHODEN
9
2.1
MATERIAL
9
2.1.1
CHEMIKALIEN
9
2.1.2
OPTISCHE
FILTER
9
2.1.3
LOESUNGEN
9
2.2
METHODEN
10
2.2.1
HALTUNG
DER
SEEIGEL
10
2.2.2
ENTNAHME
DER
SPERMIEN
10
2.2.3
VITALITAETSBESTIMMUNG
DER
SPERMIEN
11
2.2.4
BELADUNG
DER
SEEIGEL-SPERMIEN
MIT
CA
2+
-,
PH-INDIKATOREN UND
CAGED
11
ZYKLISCHEN
NUKLEOTIDEN
2.2.4.1
CA
2+
-INDIKATOR
11
2.2.4.2
PH-INDIKATOR
11
2.2.4.3
ENGE
^-ZYKLISCHE
NUKLEOTIDE
12
2.2.5
PRINZIP
DER
STOPPED
UND
QUENCHED-FLOW-MESSUNGEN
12
2.2.5.1
AUFBAU
DER
STOPPED-FLOW-APPARATUR
13
2.2.5.2
AUFBAU
DER
ANLAGE
FUER
FLUORESZENZMESSUNGEN
14
2.2.5.3
DURCHFUEHRUNG
DER
FLUORESZENZMESSUNGEN
16
2.2.6.1
AUFBAU
DER
ANLAGE
FUER
QUENCHED-FLOW-MESSUNGEN
18
2.2.6.2
DURCHFUEHRUNG
DER
QUENCHED-FLOW-MESSUNGEN
18
2.2.6.3
AUSWERTUNG
DER
QUENCHED-FLOW-PROBEN
20
3
ERGEBNISSE
21
3.1
OPTIMIERUNG
DER
METHODEN
21
3.1.1
QUENCHED-FLOW-METHODE
21
3.1.1.1
WERDEN
DIE
SPERMIEN
DURCH
DEN
MISCHVORGANG
GESCHAEDIGT?
21
3.1.1.2
WIRD
DIE
CNMP-RUHEKONZENTRATION
DURCH
DEN
MISCH
VORGANG
22
VERAENDERT?
3.1.1.3
VERAENDERT
SICH
DIE
CNMP-RUHEKONZENTRATION
WAEHREND
EINES
23
EXPERIMENTS?
3.1.1.4
WIELASSENSICH
SAP-KONTAMINATIONENENTFERNEN?
24
3.1.2
AEOPPE^-F/OW-MESSUNGEN
26
3.1.2.1
CA
2+
-MESSUNGEN
26
3.1.2.1.1
BESCHREIBUNG
DES
RESACT-INDUZIERTEN
CA
-SIGNALS
26
3.1.2.1.2
DAS
RESACT-INDUZIERTE
FLUORESZENZSIGNAL
ZEIGT
EINE
AENDERUNG
DER
29
INTRAZELLULAEREN
CA
2+
-KONZENTRATION
AN
3.1.2.1.3
WERDEN
DIE
MESSSIGNALE
DURCH
DEN MISCHVORGANG
BEEINTRAECHTIGT?
31
3.1.2.1.4
WELCHEN
EINFLUSS
HAT
DIE
BELADUNGSDAUER
MIT
FLUO-4
AUF
DIE
FORM
32
DES
CA
2+
-SIGNALS?
3.1.2.1.5
WELCHER
PUFFER
IST
AM
BESTEN
FUER
DIE
BELADUNG
DER
SPERMIEN
MIT
34
FLUO-4
GEEIGNET?
3.1.2.1.6
IST
ES
NOTWENDIG
DEN
EXTRAZELLULAEREN
INDIKATOR
NACH
DER
BELADUNG
ZU
36
ENTFERNEN?
3.1.2.1.7
AENDERT
SICH
DIE
FORM
DES
CA
2+
-SIGNALS
WAEHREND
EINES
EXPERIMENTS?
38
3.1.2.1.8
AENDERN
SICH
FORM
UND
AMPLITUDE
DER
CA
2+
-SIGNALE
IM
LAUFE
DER
40
LAICHZEIT?
3.1.2.1.9
WIE
REPRODUZIERBAR
SIND
HINTEREINANDER
GEMESSENE
CA
-SIGNALE?
41
3.1.2.2
PH-MESSUNGEN
42
3.1.2.2.1
BESCHREIBUNG
DES
RESACT-INDUZIERTEN
PH-SIGNALS
42
3.1.2.2.2
DAS
RESACT-INDUZIERTE
FLUORESZENZSIGNAL
ZEIGT
EINE
AENDERUNG
DES
44
PH-WERTS
AN
3.1.2.2.3
WIE
SCHNELL
REICHERT
SICH
BCECF
WAEHREND
DER
BELADUNG
IN
DEN
46
SPERMIEN
AN?
3.1.2.2.4
WERDEN
DIE
PH-SIGNALE
DURCH
DEN
MISCHVORGANG
BEEINTRAECHTIGT?
47
3.1.2.2.5
AENDERN
SICH
FORM
UND AMPLITUDE
DES
PH-SIGNALS
WAEHREND
EINES
48
EXPERIMENTS
BZW.
IM
LAUF
DER
LAICHZEIT?
3.1.2.2.6
WIE
REPRODUZIERBAR
SIND
HINTEREINANDER
GEMESSENE
PH-SIGNALE?
50
3.2
ZEITVERLAUF
DER
SAP-INDUZIERTEN
REAKTIONEN
52
II
3.2.1
RESACT-INDUZIERTE
AENDERUNGEN
DER
CNMP-KONZENTRATION
IN
A.
PUNCTULATA-SPERMIEN
52
3.2.1.1
RESACT
INDUZIERT
EINEN
SCHNELLEN,
TRANSIENTEN
ANSTIEG
DER
CGMP
KONZENTRATION
52
3.2.1.2
DER
PHOSPHODIESTERASE-INHIBITOR
IBMX
VERHINDERT
DIE
ABNAHME
DER
RESACT-INDUZIERTEN
CGMP-KONZENTRATION
54
3.2.1.3
DER
RESACT-INDUZIERTE
CAMP-ANSTIEG
IST
LANGSAMER
UND
KLEINER
ALS
DER
CGMP-ANSTIEG
57
3.2.1.4
IBMX
VERLANGSAMT
DEN
RESACT-INDUZIERTEN
ANSTIEG
DER
CAMP
KONZENTRATION
61
3.2.1.5
ASTEROSAP-INDUZIERTE
AENDERUNG
DER
CNMP-KONZENTRATION
IN
ASTERIAS
AMURENSIS-SPERMIEN
63
3.2.1.5.1
ASTEROSAP
INDUZIERT EINEN
GROSSEN,
SCHNELLEN
CGMP-ANSTIEG
63
3.2.2
KINETISCHE
MESSUNGEN
DER
RESACT-INDUZIERTEN
AENDERUNG
DER
CA
2+
-KONZENTRATION
69
3.2.2.1
RESACT
INDUZIERT EINEN
YYFRUEHEN
"
UND
EINEN
YYSPAETEN
"
CA
-EMSTROM
69
3.2.2.2
IBMX
VERHINDERT
DEN
RUECKGANG
DES
CA
-EINSTROMS
72
3.2.2.3
SPERMIEN
REAGIEREN
AUF
EINZELNE
RESACT-MOLEKUELE
75
3.2.2.4
COGETF-ZYKLISCHE
NUKLEOTIDE
78
3.2.2.4.1
BECMCM-CAGED-CNMP
79
3.2.2.4.2
DER
CGMP-INDUZIERTE
UND
DER
RESACT-INDUZIERTE
CA
2+
-EINSTROM
SIND
SEHR
AEHNLICH
81
3.2.2.5
CAGEJ-RESACT
85
3.2.3
KINETISCHE
MESSUNGEN
DER
RESACT-INDUZIERTEN
AENDERUNG
DES
PH-
WERTS
88
3.2.3.1
ABHAENGIGKEIT
DES
PH-SIGNALS
VON
DER
RESACT-KONZENTRATION
88
3.2.3.2
DAS
RESACT-INDUZIERTE
PH-SIGNAL
LOEST
NICHT
DEN
CA
2+
-EINSTROM
AUS
91
3.2.4
PHARMAKOLOGIE
DER
CA
-SIGNALE
93
3.2.4.1
WIRD
DAS
CA
2+
-SIGNAL
DURCH
K
+
-KANALBLOCKER
UNTERDRUECKT?
93
3.2.4.2
IST
DER
SPIH-KANAL
AN
DER
AKTIVIERUNG
DES
CA
2+
-EINSTROMS
BETEILIGT?
94
3.2.4.3
WELCHER
CA
2+
-KANAL
IST
AN
DEM
SIGNALWEG BETEILIGT?
95
3.2.4.4
REGULIEREN
PROTEINKINASEN
DEN
CA
2+
-EINSTROM?
96
4
DISKUSSION
99
4.1
WOZU
SIND
ZEITLICH
AUFGELOESTE
MESSUNGEN
AN
INTAKTEN
SPERMIEN
99
III
NOTWENDIG?
4.2
OPTIMIERUNG
UND
PROBLEME
DER
MESSMETHODE
100
4.2.1
BELADUNG
DER
SPERMIEN
MIT
FLUORESZENZINDIKATOREN
100
4.2.2
KALIBRIERUNG
DER
CA
2+
-KONZENTRATION
BZW.
DES PH-WERTS
101
4.3
ABLAUF
DER
RESACT-INDUZIERTE
REAKTIONEN
IN
ARBACIA
PUNCTULATA
102
SPERMIEN
4.4
ASTEROSAP-INDUZIERTE
AENDERUNG
DER
CGMP-KONZENTRATION
IN
110
ASTERIAS-AMURENSIS-SPERMIEN
4.5
ZUSAMMENFASSUNG
112
5
AUSBLICK
114
6
LITERATURVERZEICHNIS
115
IV |
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