Tumor-induzierte differentielle Genexpression in Monozyten:
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| Format: | Buch |
| Sprache: | German |
| Veröffentlicht: |
Göttingen
Cuvillier
2003
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| Ausgabe: | 1. Aufl. |
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| Beschreibung: | Zugl.: München, Univ., Diss., 2003 |
| Beschreibung: | VIII, 126 S. Ill., graph. Darst. |
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| adam_text | Inhaltsverzeichnis
Inhaltsverzeichnis i
Abbildungsverzeichnis v
Tabellenverzeichnis vü
1 Einleitung 1
1.1 Tumorentstehung 2
1.1.1 Epidemiologie von Kopf-Hals-Karzinomen 3
1.2 Die Immunantwort 4
1.2.1 Angeborene Immunantwort 4
1.2.2 Adaptive Immunantwort 5
1.3 Immunogenität von Tumoren 6
1.4 Tumorantigene 7
1.5 Immunevasion 9
1.6 Monozyten / Makrophagen 10
1.6.1 Zytokine und Chemokine 12
1.6.2 Immunsuppression durch Tumoren 13
1.6.3 Tumorassoziierte Makrophagen 14
1.7 PGE2, Cox und NSAIDs 15
1.8 Zielsetzung 16
2 Material 19
2.1 Antikörper 19
2.2 Bakterien 20
2.3 Chemikalien, Geräte und Sonstiges 20
2.4 Plasmide 27
2.5 Zellinien 28
3 Methoden 31
3.1 Zellkultur 31
3.1.1 Kultivierung permanenter Zellinien 31
3.1.2 Zellzahlbestimmung 32
3.1.3 Aufbewahrung von Zellinien 32
3.1.4 Rekultivierung eingefrorener Zellen 32
3.1.5 Generieren von Zellkultur-Überständen 32
3.1.6 Ausfällen von Zellkultur-Überständen 33
i
ii Inhaltsverzeichnis ^___
3.2 Isolierung von Monozyten 33
3.2.1 BuffyCoats 33
3.2.2 Vollblut 33
3.2.3 Aufbereitung der PBMZs 34
3.2.4 Anreicherung von Monozyten 34
3.3 Nukleare „Run-On -Experimente 34
3.3.1 Isolierung der Kerne aus Monozyten 34
3.3.2 „Run-On -Reaktion 35
3.3.3 Hybridisierung der RNA auf cDNA-Filter 36
3.3.4 Waschen der cDNA-Filter 36
3.4 2-D Gelelektrophorese 37
3.4.1 Monozytenaufbereirung für die 2D-PAGE 37
3.4.2 1. Dimension: Isoelektrische Fokussierung 38
3.4.3 2. Dimension: SDS-PAGE 39
3.4.4 Färbemethoden 40
3.5 Protein-Analysen über Maldi-ToF 42
3.5.1 Trypsinverdau 42
3.5.2 Beschichten der Ankerplatte 43
3.5.3 MALDI-ToF Analyse 43
3.6 Bakterienkultur 44
3.6.1 Vermehrung und Aufbewahrung 44
3.6.2 Transformation von E. coli 44
3.7 Präparative Plasmidaufarbeirung 45
3.8 Agarose-Gelelektrophorese 45
3.9 Isolierung von DNA-Fragmenten aus Agarose-Gelen 45
3.10 Transfektion von Zellen 46
3.10.1 Lipofectamin-Transfektion 46
3.10.2 Elektroporation 47
3.11 FACS-Analysen 47
3.11.1 Extrazelluläres FACS 47
3.11.2 Intrazelluläres FACS 47
3.12 Matrigel-Migrationsversuche 48
3.13 Westernblot (Immunblot) 48
3.14 Enzymimmunoassay (ELISA) und Bio-Plex-Messung 49
3.15 MTT Assay 49
3.16 Sonstige 50
4 Ergebnisse 51
4.1 Tumor-induzierte differentielle Genexpression in Monozyten 51
4.1.1 Etablierung eines zellulären Systems zur Untersuchung von
Tumor-induzierten Veränderungen in Monozyten 51
4.1.2 Veränderungen im Proteom von Monozyten 54
4.1.3 Veränderungen im Transkriptom von Monozyten 60
4.2 Interleukin-1/3 in primären Monozyten 65
4.2.1 Tumorzellen induzieren die Produktion von IL-1/3 in primären
Monozyten 65
4.2.2 Induziertes IL-1 ß wird sezerniert 66
Inhaltsverzeichnis iii
4.2.3 Interleukin-1/3 - ein Tumormarker? 70
4.2.4 Tumorzell-Überstände regulieren die Expression zusätzlicher
Zytokine in Monozyten 72
4.3 Das Plasminogen Aktivator System in primären Monozyten 76
4.3.1 Konditionierte Karzinomzell-Überstände induzieren die Pro¬
duktion von intrazellulärem PAI-2 in Monozyten 76
4.3.2 Regulation des Urokinase-Rezeptors auf Monozyten durch kon-
ditionierten Karzinomzell-Überstand 79
4.3.3 Tumorzell-Überstände beeinflussen die Migration von Monozy¬
ten durch extrazelluläre Matrix 82
4.4 Etablierung zusätzlicher Systeme zur Untersuchung der Immunsup-
pression durch Tumore 85
4.4.1 Ein zelluläres System zur Untersuchung von Cox-1 bzw. Cox-2-
vermittelten Veränderungen in Monozyten 85
4.4.2 Identifikation löslicher Faktoren von Karzinomzellen 91
5 Diskussion 95
5.1 Tumor-induzierte differentielle Genexpression in Monozyten 95
5.1.1 Etablierung zellulärer Systeme zur Untersuchung von Tumor¬
induzierten Veränderungen in Monozyten 95
5.1.2 Veränderungen im Proteom und Transkriptom von Monozyten . 98
5.2 Interleukin—Iß in primären Monozyten 99
5.2.1 Konditionierter Karzinomzell-Überstand induziert die Produk¬
tion von IL-1/5 in primären Monozyten 99
5.2.2 IL-1/3-ein Tumormarker? 100
5.2.3 Konditionierter Karzinomzell-Überstand reguliert die Expres¬
sion zusätzlicher Zytokine in Monozyten 102
5.3 Das Plasminogen Aktivator System in primären Monozyten 104
5.3.1 Konditionierter Karzinomzell-Überstand induziert die Produk¬
tion von PAI-2 in primären Monozyten 104
5.3.2 Konditionierter Karzinomzell-Überstand beeinflußt die Expres¬
sion des Urokinase-Rezeptors auf Monozyten sowie die Migra¬
tion von Monozyten durch extrazelluläre Matrix 106
6 Zusammenfassung 109
Literaturverzeichnis 111
Abkürzungsverzeichnis 121
Danksagung 125
Lebenslauf 127
Abbildungsverzeichnis
4.1 Schematische Darstellung der Probenaufbereitung für die 2D-
Gelelektrophorese und „Run-On -Technik 52
4.2 FACS-Analyse der verwendeten primären Monozyten 54
4.3 Beispiel eines 2D-Gels im pH-Bereich von pH 4-7 55
4.4 Beispiel eines 2D-Gels im pH-Bereich von pH 4.5-5.5 56
4.5 MALDI-ToF Massenspektrum am Beispiel von humanem Tropomyosin 5 57
4.6 Beispiel eines Ergebnisses der Datenbanksuche mit Massenspektrum . 57
4.7 Induktion von IL-1 ß im 2D-Gel 59
4.8 Induktion von PAI-2 im 2D-Gel 60
4.9 Gesamtansicht eines mit mRNA hybridisierten cDNA-Filters 61
4.10 Ausschnitte von Atlas cDNA Arrays, die die Induktion von IL-1;? und
PAI-2 zeigen 64
4.11 IL-1/3 Expression in Monozyten (Immunblot) 65
4.12 Schemarische Darstellung des Protokolls zur Messung der von Mono¬
zyten produzierten Zytokine im ELISA bzw. Bio-Plex-Verfahren .... 66
4.13 IL-1/3 ELISA-Messung 67
4.14 IL-1 ß Immunblot 69
4.15 IL-1/3 ELISA unter Verwendung verschiedener Karzinomzellinien ... 69
4.16 IL-1 ß Immunblot mit PBMZs von Tumorparienten und gesunden Kon¬
trollpersonen 71
4.17 Funktionsweise des Bio-Plex-Verfahrens 73
4.18 Bio-Plex-Messung der Zytokine IL-1 ß, IL-6, IL-10, IFN-7 und GM-CSF . 74
4.19 Bio-Plex-Messung der Zytokine IL-2, IL-1 und TNF-n 76
4.20 PAI-2 Immunblot 77
4.21 PAI-2 ELISA-Messung 78
4.22 Durchflußzytometrische Analyse der u-PAR Oberflächenexpression . . 80
4.23 Verlauf der u-PAR Expression auf MM-6 Zellen nach Inkubation in Me¬
dium bzw. Tumorzell-Überstand 81
4.24 Einfluß von PGE2 auf die u-PAR Expression von MM-6 Zellen (FACS) . 82
4.25 Schemarische Darstellung zum Ablauf der Matrigel-Versuche 83
4.26 Ausschnitte von Matrigel-Experimenten 84
4.27 Migration von MM-6 Zellen durch Matrigel nach Inkubation in Medi¬
um bzw. konditioniertem Karzinomzell-Überstand 85
4.28 Synthesewege der Arachidonsäuremetaboliten 86
4.29 Aufbau des für die Transfektion verwendeten Plasmids pcDNA3.1
(+)/Hyg 87
v
vi AbbildungsverTxichnis
4.30 Immunblot zum Nachweis der Cox-1 und Cox-2 Expression in transfi-
zierten ANT-1 Zellen 88
4.31 PGE2 Prcxiuktion stabil transfizierter ANT-1 Zellinien 89
4.32 Repression des u-PA Rezeptors durch die Cox-1- und Cox-2-
Transfektanten 90
4.33 2D-PAGE Auftrennung der Proteine aus synthetischem Medium .... 92
4.34 2D-PAGE Auftrennung der Proteine aus dem Karzinomzell-
Überstand der Hypopharynxkarzinom-Zellinie PCI-1 93
Tabellenverzeichnis
2.1 Verwendete Antikörper 20
2.2 Verwendete Chemikalien 23
2.3 Verwendete Verbrauchsmaterialien 24
2.4 Verwendete Geräte 26
2.5 Verwendete Plasmide 27
2.6 Verwendete Zellinien 29
3.1 Waschprotokoll für cDNA-Filter 36
3.2 Verwendete pH-Gelstreifen 38
3.3 Laufbedingungen für die Fokussierung(l. Dimension) 39
3.4 Laufbedingungen für die Gelelektrophorese (2. Dimension) 39
3.5 Coomassiefärbung 40
3.6 Silberfärbung 41
4.1 Auflistung regulierter Monozyten-Proteine, die über 2D-
Gelelektrophorese und anschließende Massenspektrometrie iden¬
tifiziert wurden 59
4.2 Auflistung regulierter Gene, die über die „Run-On -Technik identifi¬
ziert wurden 64
4.3 Zusammenstellung der für die IL-1/3 ELISA-Messung verwendeten
Zellinien 68
4.4 IL-1/? Gehalt in PBMZs von Tumorpatienten und gesunden Kontroll¬
personen 72
4.5 Bio-Plex-Messung der Zytokine eines repräsentativen Spenders .... 75
4.6 Auflistung von Proteinen, die durch die Aktivität von Cox-1 bzw. Cox-
2 differentiell exprimiert werden 91
vii
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