Regulation der Proliferation primärer Fibroblasten aus dem Myokard adulter Ratten:
Gespeichert in:
1. Verfasser: | |
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Format: | Buch |
Sprache: | German |
Veröffentlicht: |
Berlin
Logos-Verl.
2003
|
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Beschreibung: | Zugl.: Würzburg, Univ., Diss., 2003 |
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I
NHALTSVERZEICHNIS
INHALTSVERZEICHNIS
.
YY.YY.^.1
1.
EINLEITUNG
_
_
-
.
5
1.1
D
IE
B
EDEUTUNG
VON
H
ERZ
-K
REISLAUF
-E
RKRANKUNGEN
.
5
1.1.1
DIE
HERZINSUFFIZIENZ
ALS
KRANKHEIT
DES
ALTERS
.6
1.1.2
DEFINITION
UND
URSACHEN
DER
HERZINSUFFIZIENZ
.
6
1.1.3
ADAPTION
DES
HERZMUSKELS:
HYPERTROPHIE
VERSUS
HYPERPLASIE
.
8
1.1.4
DAS
STRUKTURELLE
REMODELLING
DES
HERZENS
IM
RAHMEN
DER
HYPERTROPHIE
.
9
1.1.4.1
MYOKARDFIBROSE
UND
HERZINSUFFIZIENZ
.
9
1.2
R
OLLE
VON
W
ACHSTUMSFAKTOREN
.
10
1.2.1
SIGNALE
-
REZEPTOREN
-
SIGNALTRANSDUKTION.10
1.2.2
UEBERSICHT
UEBER
DIE
REZEPTORFAMILIEN
DER
ZYTOKINE
.
10
1.2.2.1
REZEPTOR
PROTEIN-TYROSIN
KINASEN
.
10
1.2.2.2
REZEPTOR
PROTEM-SERIN/THREONIN
KINASEN
.
11
1.2.2.3
WEITERE
REZEPTORFAMILIEN
.
11
1.2.3
PDGF
UND
SEIN
REZEPTOR
.12
1.2.4
DURCH
PDGF
AKTIVIERBARE
SIGNALWEGE
.14
1.2.4.1.
INTERAKTIONEN
MIT
SH2-,
SH3
UND
PH-DOMAENEN
ENTHALTENDEN
PROTEINEN
.
14
1.2.4.2
DER
PHOSPHOLIPASE
C
SIGNALWEG
.
15
1.2.4.3
DER
PHOSPHATIDYLINOSITOL-3
KINASE
SIGNALWEG
.
15
1.2.4.4
DER
RAS/MAPK
SIGNALWEG
.
16
1.2.4.5
SIGNALWEGE
VIA
SRC-KINASEN
.
17
1.3
D
IE
PKC-F
AMILIE
UND
IHRE
R
OLLE
IM
H
ERZMUSKEL
.
17
1.3.1
HUMORALE
AKTIVIERUNG
DER
PKCS
.
18
1.3.2
MEMBRANSTANDIGE
PKC-SUBSTRATE.18
1.3.3
PKC
UND
HERZHYPERTROPHIE.
19
1.4
D
AS
R
ENIN
-A
NGIOTENSIN
-S
YSTEM
(RAAS)
.
19
1.5
K
ONTROLLE
DER
P
ROLIFERATION
(Z
ELLZYKLUSKONTROLLE
)
.
20
1.6
Z
IELSTELLUNG
DER
A
RBEIT
.23
2
MATERIAL
UND
METHODEN
.
24
2.1
V
ERBRAUCHSMATERIAL
UND
G
ERATE
.
24
2.2
C
HEMIKALIEN
.
25
2.3
M
OLEKULARBIOLOGISCHE
M
ETHODEN
.27
2.3.1
BAKTERIENSTAEMME
.
27
2.3.1.1
DER
E.COLI
STAMM
JM
109
.
27
2.3.1.2
DER
E.
COLI
STAMM
TOPIOF
(FA.
INVITROGEN)
.
27
2.3.2
KULTURMEDIEN
FUER
BAKTERIENKULTUREN
.27
2.3.3
PLASMIDVEKTOREN
.
28
2.3.3.1
PBLUESCRIPT
IISK
(+)
(FA.
STRATAGENE)
.28
2.3.3.1
PEGFP-NL
(FA.
CLONTECH)
.28
2.3.3.3
PCR
2.1-T0P0
(FA.
INVITROGEN)
.28
2.3.4
OLIGONUKLEOTIDE
.
29
2.3.5
ISOLIERUNG
UND
REINIGUNG
VON
NUKLEINSAEUREN
(NACH
CHOMZYNSKI
UND
SACCHI,
1987)
.
31
2.3.5.1
ISOLIERUNG
EUKARYONTISCHER
RNA
.
31
2.3.5.2
PLASMIDPRAEPARATION
AUS
E.COLI
DURCH
ALKALISCHE
LYSE
(BIRNBOIM
UND
DOLY,
1979)
.
31
2.3.5.3
PHENOLEXTRAKTION
UND
ETHANOLFHLLUNG
.
32
2.3.6
ANALYSE
VON
NUKLEINSAEUREN
.
32
2.3.6.1
SPEKTRALPHOTOMETNSCHE
BESTIMMUNG
DER
NUKLEINSAEUREKONZENTRATION
.
32
2.3.6.2
AGAROSEGELELEKTROPHORESE
VON
RNA
UND
DNA
.
33
2.3.6.3
AGAROSEGELELEKTROPHORESE
VON
RNA
UNTER
DENATURIERENDEN
BEDINGUNGEN
.
33
2.3.6.4
DNA-SEQUENZIERUNG
.
34
2.3.7
ENZYMATISCHE
MODIFIZIERUNG
VON
NUKLEINSAEUREN
.
34
2.3.7.1
CDNA-ERSTSTRANGSYSNTHESE
DURCH
REVERSE
TRANSKRIPTION
.
34
2.3.7.2
RADIOAKTIVE
MARKIERUNG
VON
DNA-SONDEN
DURCH
RANDOM-PRIMMG
.
34
2.3.8
POLYMERASE-KETTENREAKTION
.
35
2.3.8.1
AMPLIFIKATION
EINZELSTRAENGIGER
CDNA
(RT-PCR)
.
35
2.3.8.2
SEMIQUANTITATIVE
RT-PCR
.
35
2.3.8.3
SINGLE-CELLRT-PCR
.
36
2.3.8.4
FAMILIEN-SPEZIFISCHES
DIFFERENTIALDISPLAY
(FSD-DD-TECHNIK)
.37
2.3.8.5
IDENTIFIZIERUNG
POSITIV
TRANSFORMIERTER
BAKTERIEN
DURCH
PCR
.
41
2.3.8
6
REINIGUNG
VON
PCR-PRODUKTEN
.
41
2.3.9
DNA-TRANSFER
IN
E.COLI
.
41
2.3.9.1
TRANSFORMATION
PLASMIDISCHER
DNA
DURCH
ELEKTROPORATION
IN
E.COLI
.
41
2.3.9.2
SELEKTION
DER
TRANSFORMIERTEN
ZELLEN
.
42
2.3.9.3
ANLEGEN
VON
STAMMKULTUREN
.
42
2.4
P
ROTEINCHEMISCHE
M
ETHODEN
.
43
2.4.1
ANTIKOERPER
.43
2.4.1.1
PRIMAERANTIKOERPER
.43
2.4.1.2
SEKUNDAERANTIKOERPER
.
43
2.4.2
HERSTELLUNG
VON
PROTEINLYSATEN
AUS
KARDIOFIBROBLASTEN
UND
MYOZYTEN
.
43
2.4.3
SDS-POLYACRYLAMIDGELELEKLROPHORESE
(SDS-PAGE)
.
43
2.5
T
RANSFERTECHNIKEN
.
44
2.5.1
NORTHERN
BLOT
.
.
.
.44
2.5.2
WESTERN
BLOT
.
45
2.6
D
URCHFLUSSZYTOMETRISCHE
M
ETHODEN
.
46
2.
6.1
MESSUNG
DER
GFP-EXPRESSION
.
46
2.6.2
DNA-FAERBUNG
MIT
HOECHST
33258
UND
ZELLZYKLUSANALYSE
.
47
2.6.3
NACHWEIS
DER
EXPRESSION
HA-GETAGGTER
PROTEINE
.
48
2.6.4
SORTIEREN
VON
EINZELNEN
KARDIALEN
MYOZYTEN
.
49
2.7
Z
ELLBIOLOGISCHE
T
ECHNIKEN
.
49
2.7.1
TIERE
.49
2.7.2
ISOLIERUNG
VON
KARDIOFIBROBLASTEN
UND
HERZMYOZYTEN
.
.
.
50
2.7.3
KULTIVIERUNG
DER
ZELLEN
.
51
2.7.3.1
KULTIVIERUNG
DER
MYOZYTEN
.
51
2.7.3.2
KULTIVIERUNG
DER
KARDIOFIBROBLASTEN
.
51
2.7.4
BESTIMMUNG
VON
ZELLZAHL
UND
ZELLVOLUMEN
.51
2.7.5
ZELLPASSAGE
.
52
2.7.6
STIMULATION
VON
SYNCHRONISIERTEN
ZELLEN
.52
2.7.7
ZELLFIXIERUNG
.52
2.7.8
TRANSFEKTION
VON
KARDIOFIBROBLASTEN
.52
3.
ERGEBNISSE
.
54
3.1
E
INFLUSS
DER
P
ROTEINKINASE
A
KT
AUF
DIE
P
ROLIFERATION
VON
KULTIVIERTEN
K
ARDIOFIBROBLASTEN
.
54
3.1.1
PDGF
WIRKT
IN
VITRO
STARK
MITOGEN
AUF
KARDIOFIBROBLASTEN
.
54
3.1,2
ANWENDUNG
DER
FSD-DD-TECHNIK
ZUR
UNTERSUCHUNG
DER
DIFFERENZIELLEN
GENEXPRESSION
.
55
3.1.3
AKTAIST
SOWOHL
TRANSKRIPTIONELL
ALS
AUCH
TRANSLATIONELL
DIFFERENZIELL
EXPRIMIERT
.
58
3,1.4
DIE
PROTEINKINASE
AKTAWIRD
IN
VERSCHIEDENEN
ORGANEN
UNTERSCHIEDLICH
STARK
EXPRIMIERT
.61
3.1.5
UEBEREXPRESSION
VON
AKT
FUEHRT
IN
VITRO
ZU
EINER
VERAENDERTER
PROLIFERATIONSRATE
VON
KARDIOFIBROBLASTEN
.
62
3.1.6
DIE
PROTEIN
KINASE
C-^ALS
ZWEITE
DIFFERENZIELL
EXPRIMIERTE
PROTEINKINASE
INNERHALB
DER
PI3
KINASE-KASKADE
.
64
3.1.6.1
DIE
ISOFORMEN
DER
PKC
UND
DEREN
INTRAZELLULAERE
LOKALISATION
IN
KULTIVIERTEN
KARDIOFIBROBLASTEN
.
65
3.1.6.2
DIE
EXPRESSION
DER
PKC-
IN
VERSCHIEDENEN
ZELLTYPEN
DES
RATTENMYOKARDS
.
65
3.2
A
NGIOTENSIN
II
ALS
M
ITOGEN
IN
KULTIVIERTEN
K
ARDIOFIBROBLASTEN
.
67
3.2.1
DER
MITOGENE
EFFEKT
VON
ANGIOTENSIN
11
IST
ZELLDICHTEABHAENGIG
.
67
3.2.2
AKTIVIERUNG
DER
MAPK
UND
TYROSINPHOSPHORYLIERUNG
ERKLAEREN
NICHT
DIE
DURCH
ANG
II
ABHAENGIGE
PROLIFERATION
.68
3.2.3
ANGIOTENSIN
II
BEEINFLUSST
DIE
MRNA-EXPRESSION
VON
PDGF-AA
UND
TGF-SSL
.69
3.2.4
DIE
ANG
II
INDUZIERTE
PROLIFERATION
IST
ZEITLICH
VERZOEGERT
.
71
3.2.5
DIE
ANGIOTENSIN
II
INDUZIERTE
PROLIFERATION
KANN
NEUTRALISIERT
WERDEN
.
72
3.3
G
ENEEXPRESSIONSTUDIEN
IN
HETEROGENEN
Z
ELLPOPULATIONEN
AUS
H
ERZEN
ADULTER
R
ATTEN
.
.74
3.3.1
KULTIVIERTE
MYOZYTEN
AUS
DEM
MYOKARD
ADULTER
RATTEN
LASSEN
SICH
MIT
EINEM
DURCHFIUSSZYTOMETER
AUFREINIGEN
.
74
3.3.2
DIE
RNA
AUS
ETHANOL-FIXIERTEN
MYOZYTEN
IST
FUER
NORTHERN
BLOTS
GEEIGNET
.
77
3.3.3
MYOZYTENSPEZIFISCHE
MRNA-TRANSKRIPTE
LASSEN
SICH
AUCH
IN
EINIGEN
WENIGEN
FIXIERTEN
UND
SORTIERTEN
MYOZYTEN
NACHWEISEN.78
4
DISKUSSION
.
81
4.1
D
IFFERENZIELLE
G
ENEXPRESSION
IN
ALTERNDEN
K
ARDIOFIBROBLASTEN
.
81
4.1.1
DIFFERENTIAL
DISPLAY
TECHNIKEN
IM
LABORALLTAG.81
4.1.2
DIE
VIER
DURCH
DIE
FSD-DD-TECHNIK
GEFUNDENEN
KINASEN
.
82
4.1.2.1
DIE
PROTEINKINASE
N,
PKN
.
83
4.1.2.2
DIE
PYRUVATKINASE
.83
4.1.2.3
DIE
NUKLEOSID-DIPHOSPHAT-KINASE,
NDPK
.
84
4.1.2.4
DIE
AKT
KINASE,
PKB
.
84
4.1.3
DIE
ROLLE
DER
PROTEINKINASE
C-C
.
91
4.1
3.1
DIE
DIFFERENZIELL
EXPNMIERTE
PKC-
.91
4.2
D
IE
MITOGENE
W
IRKUNG
VON
A
NGIOTENSIN
N
.
92
4.2.1
DAS
RENIN-ANGIOTENSIN-ALDOSTERON
SYSTEM.
92
4.2.2
ZELLDICHTE-ABHAENGIGE
MITOGENE
WIRKUNG
VON
ANGIOTENSIN
II
IN
VITRO
.
93
4.2.3
SYNERGISMUS
VERSCHIEDENER
WACHSTUMSFAKTOREN
.
95
4.2.4
PHYSIOLOGISCHE
RELEVANZ
.
96
4.3
G
ENEXPRESSION
IN
FACS
SORTIERTEN
K
ARDIOMYOZYTEN
.
97
4.3.1
DURCHFLUSSZYTOMETRIE
UND
SORTIEREN
VON
KARDIOMYOZYTEN
.
97
4.3.2
KONVENTIONELLE
METHODEN
ZUR
EINZELZELLGEWINNUNG
.
98
4.3.3
PRAKTISCHE
RELEVANZ
DER
METHODE
.
99
ZUSAMMENFASSUNG
_
101
LITERATURVERZEICHNIS
_
103
ANHANG
_
109
A
A
BKUERZUNGEN
.109
B
A
LLGEMEINE
D
ATEN
.
111
B
1
PICOMOL
ENDEN
PRO
MIKROGRAMM
DOPPELSTRAENGIGER
DNA
.
111
B
2
PHYSIKALISCHE
EIGENSCHAFTEN
DER
VERWENDETEN
RADIOISOTOPE
.
111
B
3
UMRECHNUNG
DER
RADIOAKTIVITAET
.
111
C
G
ENETISCHER
K
ODE
.
111
DANKSAGUNG
_
112
LEBENSLAUF.
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