Struktur und Funktion von Hsp12 aus der Bäckerhefe S. cerevisiae:
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2003
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INHALTSVERZEICHNIS
I
1. EINLEITUNG
1
1.1. DIE STRESSANTWORT IN HEFE---
1.1.1. MOLEKULARE UND PHYSIOLOGISCHE VERAENDERUNGEN IN HEFE BEI STRESS
1.1.2. DIE HITZESCHOCKPROTEINE (HSPS) IN
S. CEREVISIAE.
1
1
5
12
. YYKLEINE" HITZESCBOCKPROTEINE (A-HSPS)
1.2.1. ALLGEMEINE MERKMALE DER YYKLEINEN" HITZESCHOCKPROTEINE.9
1.2.2. STRUKTUR DER A-HSPS.11
1.2.3. FUNKTION DER A-HSPS.15
13
. HSPL2 AAS S. CEREVISIAE
17
1.4. NATIV ENTFETTETE PROTEINE.
21
1.5.
PROMEMSTEONNG
25
2. MATERIAL UND METHODEN
27
2.1. ORGANISMEN UND VEKTOREN.
27
22. VERWENDETE OHGONUKLEOTIDE YY.-._29
23
. VERWENDETES MATERIAL
.30
2.3.1. CHEMIKALIEN.30
2.3.2. GROESENSTANDARDS UND KITS.31
2.3.3. PROTEINE.32
2.3.4. ANTIKOERPER.32
2.3.5. CHROMATOGRAPHIEMATERIALIEN.32
2.3.6. SONSTIGES MATERIAL.33
2.3.7. GERAETE.33
2.3.8. COMPUTERPROGRAMME.35
2.4
NAEHNNEDIEN AND ANTIBIOTIKA
2.4.1. MEDIEN ZUR ANZUCHT VON
E. COLI.
2.4.2. MEDIEN ZUR ANZUCHT VON
S. CEREVISIAE:
36
36
37
2.5. PUFFER -37
2.5.1. LOESUNGEN FUER MOLEKULARBIOLOGISCHE METHODEN.37
2.5.2. LOESUNGEN FUER PROTEINCHEMISCHE METHODEN.38
BIBLIOGRAFISCHE INFORMATIONEN
HTTP://D-NB.INFO/968628664
INHALTSVERZEICHNIS
II
2.6.
MOIEKNLARBIOLOGISCHE METHODEN.-.~.-.-.-.39
2.6.1. KULTIVIERUNG UND KONSERVIERUNG VON ORGANISMEN.39
2.6.1.1 KULTIVIERUNG UND KONSERVIERUNG VON E. COLI.39
2.6.1.2 KULTIVIERUNG UND KONSERVERVIERUNG VON S. CEREVISIAE.40
2.6.2. ALLGEMEINE MOLEKULARBIOLOGISCHE METHODEN.40
2.6.2.1 AUFTRENNUNG VON DNA DURCH AGAROSEGELELEKTROPHORESE.40
2.6.2.2 DNA-ISOLIERUNG AUS AGAROSEGELEN.40
2.6.2.3 REINIGUNG VON PCR-PRODUKTEN UND DNA-FRAGMENTEN.40
2.6.2.4 TRANSFORMATION VON E. COLI.41
2.6.2.5 LITHIUMACETET-METHODE ZUR TRANSFORMATION VON S. CEREVISIAE.41
2.6.3. PCR-METHODEN.42
2.6.3.1 PCR-AMPLIFIKATION.42
2.6.3.2 KLONIERUNG VON PCR-PRODUKTEN.43
2.6.4. ENZYMATISCHE MODIFIZIERUNG VON DNA.43
2.6.4.1 DNA-SPALTUNG DURCH RESTRIKTIONSENZYME. 43
2.6.4.2 DEPHOSPHORYLIERUNG VON DNA-ENDEN.44
2.6.4.3 LIGATION VON DNA-FRAGMENTEN.44
2.7. PROTEINCHEMISCHE METHODEN -.-.- .44
2.7.1. PROTEIN-GELELEKTROPHORESE.44
2.7.1.1 SDS-POLYACRYLAMID-GELELEKTROPHORESE.44
2.7.1.2 NATIVE GELELEKTROPHORESE.45
2.7.2. PROTEIN-FAERBEMETHODEN.46
2.7.2.1 SILBERFAERBUNG (HEUKESHOVEN UND DERNICK, 1988).46
2.7.2.2 FAERBUNG NACH FAIRBANKS (FAIRBANKS ET AL., 1971).46
2.7.3. BESTIMMUNG DER PROTEINKONZENTRATION. 47
2.7.3.1 KONZENTRATIONSBESTIMMUNG NACH BRADFORD.47
2.13.2
KONZENTRATIONSBESTIMMUNG DURCH UV-ABSORPTIONSSPEKTROSKOPIE.47
2.7.4. IMMUNOBIOTTING (WESTERN BLOT).48
2.7.5. PROTEIN-SEQUENZBLOT.49
2.7.6. IMMUNPRAEZIPTATION. 50
2.8. CHROMATOGRAPHIE 51
2.8.1. IONENAUSTAUSCHCHROMATOGRAPHIE.51
2.8.2. HYDROPHOBE INTERAKTIONSCHROMATOGRAPHIE.51
2.8.3. GELFILTRATIONSCHROMATOGRAPHIE.52
2.8.4. AFFINITAETSCHROMATOGRAPHIE.52
2.8.5. HYDROXYAPATIT-CHROMATOGRAPHIE.53
2.9. PRAEPARATIVE METHODEN.----.53
2.9.1. ZELLAUFSCHLUSS.53
INHALTSVERZEICHNIS
III
2.9.2. PROTEINEXPRESSIONSNACHWEIS IN HEFE.54
2.9.3. PROTEINPRAEZIPITATION.54
2.9.4. AUFKONZENTRIERUNG UND DIALYSE VON PROTEINEN.55
2.9.5. REINIGUNG VON HSPL2 AUS
E. COLI.55
2.9.6. RE
INIGUNG VON HSPL2 AUS S. CEREVISIAE.57
2.9.7. REINIGUNG VON HIS-HSPL2 AUS
E. COLI.58
2.9.8. REINIGUNG VON WHLL AUS
E. COLI.59
2.9.9. REINIGUNG VON YHX7P AUS
E. COLI.60
2.9.10. REINIGUNG VON AKTIN AUS 5.
CEREVISIAE.61
2.10. SPEKTROSKOPIE
2.10.1. UV-ABSORPTIONSSPEKTROSKOPIE.
2.10.2. FLUORESZENZSPEKTROSKOPIE.,
2.10.3. CD-SPEKTROSKOPIE.
2.10.4. NMR-SPEKTROSKOPIE.
2.10.4.1 KEMSPINRESONANZ.
2.10.4.2 CHEMISCHE VERSCHIEBUNG
2.10.4
3 LD-NMR-SPEKTROSKOPIE.
2.10.4.4 2D-NMR-SPEKTROSKOPIE.
62
.62
.63
.65
.66
.66
.67
.68
.68
2.11.
DYNAMISCHE
LFCHTSTREIIIING.~.
69
2.12. PLASMON-RESONANZ-SPEKTROSKOPIE .70
2.13. ELEKTRONENMIKROSKOPIE.71
2.14. FUNKTIONSASSAYS.72
2.14.1. NACHWEIS DER RIBOSOMENASSOZIATION.72
2.14.1.1 PRAEPARATION DER ZELLLYSATE ZUR DARSTELLUNG UND ANALYSE
RIBOSOMALER PARTIKEL.72
2.14.1.2 SACCHAROSEGRADIENTEN UND PRAEPARATION RIBOSOMALER PARTIKEL.73
2.14.2. AKTIN-ASSAYS.73
2.14.2.1 AKTINPOLYMERISATION.'.73
2.14.2.2 PELLETING-ASSAY.74
3. ERGEBNISSE.75
3.1. STRUKTURELLE CHARAKTERISIERUNG VON HSPL2-.-.---.75
3.1.1. HSPL2 AUS
S. CEREVISIAE.76
3.1.2. HSP 12 UND MIZELLEN.80
3.1.2.1 HSPL2 UND NDSB-195.80
3.1.2.2 HSPL2 UND ANIONISCHE ALKYLSULFATE.81
INHALTSVERZEICHNIS
IV
3.1.2.3 HSPL2 UND ALKOHOLE.86
3.1.3. TEMPERATURSTABILITAET VON HSPL2.88
3.1.3.1 EINFLUSS DER TEMPERATUR AUF DIE SEKUNDAERSTRUKTUR VON HSPL2.88
3.1.3.2
EINFLUSS
VON TEMPERATUR AUF DIE LOESLICHKEIT VON HSPL2.93
3.1.4. DYNAMISCHE LICHTSTREUUNG MIT HSPL2.94
3.1.5. HSPL2 IM TRANSMISSIONSELEKTRONENMIKROSKOP.95
3.1.6. KRISTALLISATION VON HSPL2.96
3.1.7. NMR-MESSUNG MIT HSPL2.97
3.1.8. WHLL AUS CANDIDA ALBICANS.10O
3.1.8.1 KLONIERUNG UND EXPRESSION VON WH11.100
3.1.8.2 REINIGUNG VON WHLL.100
3.1.8.3 PRIMAERSTRUKTUR VON WHLL. 101
3.1.8.4 SEKUNDAERSTRUKTUR VON WHLL.102
3
2.
FUNKTIONALE CHARAKTERISIERUNG VON HSPL2.104
3.2.1. ERSTE ARBEITSHYPOTHESE - HSPL2 UND DAS RIBOSOM.104
3.2.2. ZWEITE ARBEITSHYPOTHESE - HSPL2 UND AKTIN.107
3.2.2.1 EINFLUSS VON HSPL2 AUF DIE AKTINPOLYMERISATION.108
3.Z2.2 BINDUNG VON HSPL2 AN AKTIN.110
3.2.3. DRITTE ARBEITSHYPOTHESE - DIE SUCHE NACH POTENTIELLEN
HSPL2-PARTNERPROTEINEN.114
3.2.3.1 SUCHE UND IDENTIFIKATION VON MOEGLICHEN PARTNERPROTEINEN.114
3.2.3.2 NATIVE GELELEKTROPHORESE MIT HSPL2.115
3.23.3 WECHSELWIRKUNG VON HSPL2 MIT DEN POTENTIELLEN
PARTNERPROTEINEN.117
3.2.4. VIERTE ARBEITSHYPOTHESE - HSPL2 ALS YYANTI-FREEZING PROTEIN".119
3.2.5. FUENFTE ARBEITSHYPOTHESE - HSPL2 EIN ZELLWANDPROTEIN.121
4. DISKUSSION
123
4.1. HSPL2 - EIN NATIV ENTFALTETES PROTEIN-123
4.2. HSPL2 - EIN RIBOSOMENBINDENDES PROTEIN? -130
43. HSPL2 - EIN AKTINBINDENDES PROTEIN?
131
4.4. HSPL2 - DIE SUCHE NACH DEM PARTNER.
134
4.5. HSPL2 - EIN ANTIFREEZING PROTEIN?
140
4.6. HSPL2 - EIN PROTEIN IN DER ZELLHUELLE?.142
4.6.1. HSPL2 - EIN MEMBRANPROTEIN?.142
4.6.2. HSPL2 - EIN PROTEIN DER ZELLWAND?.147
INHALTSVERZEICHNIS
V
5. ZUSAMMENFASSUNG.151
LITERATURVERZEICHNIS
ABKUERZUNGEN |
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