Infektion dendritischer Zellen mit murinem Zytomegalovirus: Virus-induzierte Veränderungen des zellulären Phänotyps und ihre Bedeutung für die antivirale Immunantwort
Gespeichert in:
1. Verfasser: | |
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Format: | Buch |
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Veröffentlicht: |
2003
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Beschreibung: | München, Univ., Diss., 2003 |
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INHALTSVERZEICHNIS
I ZUSAMMENFASSUNG_4
N EINLEITUNG_ 6
N. 1
ZYTOMEGALOVIRUS, EIN MITGLIED DER HERPESVIRUSFAMILIE.6
II. 1.1 VIRUSSTRUKTUR UND ORGANISATION DES CMV-GENOMS.7
II. 1.2 GENEXPRESSION UND REPLIKATION VON ZYTOMEGALIEVIREN.10
N.1.3 BIOLOGIE DER INFEKTION, PERSISTENZ UND LATENZ VON CMV.14
II. 1.4 KLINISCHE RELEVANZ EINER CMV-INFEKTION.16
II. 1.5 MURINES ZYTOMEGALOVIRUS ALS MODELL FUER HCMV.18
II. 1.6 IMMUNANTWORT GEGEN MCMV.18
N.2 DENDRITISCHE ZELLEN UND IHRE ROLLE IN DER IMMUNANTWORT.21
UE.2.1 HERKUNFT UND ENTWICKLUNG HUMANER UND MURINER DENDRITISCHER
ZELLEN.22
II. 2.2 ANTIGEN-AUFNAHME, MIGRATION UND REIFUNG VON DCS.24
N.2.3 ANTIGEN-PROZESSIERUNG UND ANTIGEN-PRAESENTATION DURCH DCS.25
N.2.4 T-ZELL-DC INTERAKTION.27
UE.2.5 VIRALE INTERAKTION MIT DENDRITISCHEN ZELLEN.29
N.2.6 ZYTOMEGALOVIRUS UND DCS.32
N.3 FRAGESTELLUNG UND ZIEL DER ARBEIT.33
M MATERIAL UND METHODEN_34
III. 1 MATERIAL.34
III. 1.1 REAGENZIEN.34
III. 1.2 ANTIKOEIPER.36
IN. 1.3 OLIGONUKLEOTIDE.37
NI. 1.4 PLASMIDE.37
III. 1.4A ERHALTENE ODER KOMMERZIELL ERWORBENE PLASMIDE UND
MCMV-BAC-PLASMIDE
.37
III.1.4.B BESCHREIBUNG SELBST-KONSTRUIERTER PLASMIDE
UNDMCMV-BAC-PLASMIDE. 38
IN. 1.5 IM SOUTHERN BLOT VERWENDETE SONDEN.41
NI.1.6 ZELLEN UND VIREN.42
III.2 METHODEN.43
M.2.1 MOLEKULARBIOLOGISCHE METHODEN.43
III. 2. LA ISOLIERUNG UND REINIGUNG VON NUKLEINSAEUREN.43
111.2. LA. 1 PRAEPARATION VON PLASMID-DNA
.
43
111.2.1. A.2 ISOLIERUNG VON BAC-DNA
.
44
IH.2.1.A.3 ISOLIERUNG VIRALER DNA AUS ZELLEN
.
45
111.2.1. A.4 ISOLIERUNG VON MCMV-DNA AUS VIRIONEN
-.
46
111.2.1. A.5 KONZENTRIERUNG UND KONZENTRATIONSBESTIMMUNG VON DNA
.
46
111.2.1. B KLONIERUNG VON PLASMIDEN
.46
IU.2.I.B.I VERDAU VON DNA MIT RESTRIKTIONSENZYMEN
.
46
IK2.1.B.2 ISOLIERUNG VON DNA-FRAGMENTEN AUS AGAROSEGELEN
.
47
111.2.1. B.3 LIGATION
.
47
111.2.1. B.4 OLIGONUKLEOTIDE: ZUSAMMENFUHRUNG ZUM DOPPELSTRANG UND
KLONIERUNG IN PLASMIDE .47
111.2.1. B.5 HERSTELLUNG ELEKTROKOMPETENTER BAKTERIEN
.
48
IUE.2.1.B.6 TRANSFORMATION VON ELEKTROKOMPETENTEN BAKTERIEN
.
48
111.2. L.B. 7 HERSTELLUNG VON GLYCERINSTAMMKULTUREN
.
48
111.2.1. C METHODEN ZUR DNA-ANALYSE
.49
111.2.1. C.1 GELELEKTROPHORESE.
.
49
111.2.1. C.2 SOUTHERN BLOT
.
49
111.2.1. D POLYMERASE-KETTEN-REAKTION (PCR)
.32
111.2.1. E MUTAGENESE VON MCMV-BAC PLASMIDEN IN E. COLI BAKTERIEN.52
111.2.1. E.2 TRANSFORMATION LINEARER FRAGMENTE IN
REKOMBINATIONS-KOMPETENTE BAKTERIEN
.
53
111.2.1. E.3 ENTFERNUNG DES MIT FRT-SEQUENZEN FLANKIERTEN
KANAMYCIN-SELEKTIONSMARKERS
.
54
1
BIBLIOGRAFISCHE INFORMATIONEN
HTTP://D-NB.INFO/968464807
INHALTSVERZEICHNIS
111.2.2 ZELLKULTUR. 54
111.2.2. A KULTIVIERUNG VON NIH3T3, M2-10B4 UND MEF-ZELLEN
.54
111.2.2. B FDCP-MIX ZELLKULTUR.55
111.2.2. CAUFTAUEN VON ZELLEN
.55
111.2.2. D ABTRENNUNG TOTER ZELLEN DURCH
DICHTEGRADIENTENZENTRIFUGATION.55
111.2.2. E EINFRIEREN VON ZELLEN.56
111.2.2. FHERSTELLUNG VON KONDITIONIERTEN MEDIEN.56
III. 2.2. G DIFFERENZIERUNG DER FDCP-MIX-ZELLEN IN DENDRITISCHE
ZELLEN.58
111.2.2. HDIFFERENZIERUNG VON FDCP-MIX-ZELLEN IN MAKROPHAGEN.59
III.2.2.I TRANSFEKTION EUKARYONTISCHER ZELLEN UND
VIRUS-REKONSTITUTION.59
111.2.2. JHERSTELLUNG EINES MCMV-VIRUSSTOCKS.60
III. 2.2.K STANDARD PLAQUE ASSAY ZUR BESTIMMUNG DES VIRUSTITERS.60
111.2.2. L INFEKTION DER ZOELLEN MIT MCMV
.61
111.2.3 HERSTELLUNG VON ZYTOSPIN-PRAEPARATEN.61
FFL.2.4 IMMUNFLUORESZENZ. 61
111.2.5 ZYTOFLUOROMETRISCHE ANALYSE (FACS-ANALYSE).62
111.2.6 SS-LACTAMASE REPORTER-ASSAY.62
111.2.7 LYMPHOZYTEN-PROLIFERATIONS-ASSAY (MIXED LYMPHOCYTE REACTION,
MLR).63
IV ERGEBNISSE_ 64
IV. 1
INFEKTION VON ZELLEN DES HAEMATOPOETISCHEN SYSTEMS MIT MCMV.64
IV. 1.1 DAS LAC-OPERATOR-REPRESSOR SYSTEM ZUM NACHWEIS VIRALER DNA IM
ZELLKERN. 64
IV.1.1.A DIE LAC-OPERATOR-REPETITIONSSEQUENZ IST IM VIRALEN GENOM NICHT
STABIL.65
IV. 1.2 ETABLIERUNG VON SOUTHERN BLOT UND POLYMERASE-KETTENREAKTION
(PCR) ZUM
NACHWEIS VON MCMV-GENOMEN IN HAEMATOPOETISCHEN ZELLEN.68
IV.1.2.A NACHWEIS VIRALER DNA MIT HILFE DER POLYMERASE-KETTENREAKTION
.68
IV. 1.2.B ETABLIERUNG DES SOUTHERN BLOTS ZUM NACHWEIS ZIRKULAERER
MCMV-GENOME
NACH INFEKTION.70
IV. 1.3 MARKIERUNG DES KLEINEN MCMV-KAPSID-PROTEINS (SMALL
CAPSIDPROTEIN) MIT GFP
FUER INFEKTIONSSTUDIEN.71
IV.1.3.A KONSTRUKTION EINES SCP-GFP FUSIONSPROTEIN-KODIERENDEN
MCMV-GENOMS72
IV.1.3.B DAS KLEINE KAPSID-PROTEIN (SCP) VON MCMV IST FUER DAS VIRALE
WACHSTUM
ESSENTIELL.73
IV. 1.4 MCMV-MUTANTEN ZUM NACHWEIS VIRALER GENEXPRESSION IN
HAEMATOPOETISCHEN
ZELLEN.74
IV.1.4.A HERSTELLUNG EINER MCMV-MUTANTE MIT GFP ALS REPORTERGEN.
.74
IV.1.4.B HERSTELLUNG UND TEST EINER SS-LACTAMASE-EXPRIMIERENDEN
MCMV-MUTANTE. 77
IV.2 INFEKTION DENDRITISCHER ZELLEN MIT MCMV UND CHARAKTERISIERUNG DER
AUSWIRKUNGEN DER INFEKTION AUF DIE IMMUNANTWORT.80
IV.2.1 CHARAKTERISIERUNG MURINER DCS DIFFERENZIERT AUS
FDCP-MIX-ZELLEN.81
IV.2.2 INFEKTION UNDIFFERENZIERTER FDCP-MIX-ZELLEN UND
FDCP-MIX-ABGELEITETER
DENDRITISCHEN ZELLEN MIT MCMV.82
1V.2.2.A MCMV-INFEKTION UNDIFFERENZIERTER FDCP-MIX-ZELLEN.83
IV.2.2.B INFEKTION DENDRITISCHER ZELLEN MIT MCMV.84
IV.2.3 INFEKTIONSEFFIZIENZ DENDRITISCHER ZELLEN MIT MCMV.85
IV.2.4 MCMV-GENEXPRESSION IN DCS UNTERSCHIEDLICHER REIFUNGSSTADIEN.87
IV.2.5 PRODUKTIVE MCMV-INFEKTION UNREIFER, NICHT ABER REIFER DCS.90
IV.2.6 MCMV-INDUZIERTE PHAENOTYPISCHE VERAENDERUNGEN VON DCS.91
IV.2.7 BEEINTRAECHTIGTE T-ZELL-STIMULATION DURCH MCMV-INFIZIERTE DCS.98
IV.2.7.A EFFIZIENTE STIMULATION DER AUTOLOGEN T-ZELL-PROLIFERATION DURCH
AKTIVIERTE
MCMV-INFIZIERTE DCS
.98
2
INHALTSVERZEICHNIS
IV.2.7.B MCMV-INFIZIERTE DCS INHIBIEREN IN DER SPAETEN PHASE DER
REPLIKATION DIE
AUTOLOGE T-ZELL-PROLIFERATION.99
IV. 2.7.C MCMVINTERFERIERT MIT DER STIMULATION ALLOGENER T-ZELLEN DURCH
MHC-
UNABHAENGIGE MECHANISMEN.100
V DISKUSSION_103
V. 1 METHODEN UND MCMV-REKOMBINANTEN ZUM NACHWEIS DER INFIZIERBARKEIT
VON
ZELLEN DES HAEMATOPOETISCHEN SYSTEMS.103
V.L.L INSTABILITAET DER LAC-OPERATOR-REPETITIONSSEQUENZEN IM VIRALEN
GENOM.103
V.L .2 DAS SMALL CAPSID PROTEIN (SCP) IST FUER DAS MCMV-WACHSTUM
ESSENTIELL.104
V. 1.3 NACHWEIS VIRALER GENEXPRESSION IN HAEMATOPOETISCHEN ZELLEN MIT
HILFE VON
MCMV-MUTANTEN. 106
V.2 NICHT-PERMISSIVE INFEKTION MULTIPOTENTER HAEMATO-POETISCHER
STAMMZELLEN
MIT MCMV.107
V.3 DIE ROLLE DENDRITISCHER ZELLEN IN MCMV-INDUZIERTER
IMMUNSUPPRESSION. 109
V.3.1 INFEKTION UND REPLIKATION VON MCMV IN MURINEN DCS.111
V.3.2 MCMV-INDUZIERTE VERAENDERUNGEN DES DC-PHAENOTYPS UND MOEGLICHE
AUSWIRKUNGEN AUF DIE IMMUNANTWORT.112
V.3.3 IMMUNSUPPRESSION DURCH FUNKTIONELLE BEEINTRAECHTIGUNG VON DCS DURCH
MCMV
.114
V. 3.3.A UNTERSCHIEDE IN DER STIMULATIONSFOEHIGKEIT AUTOLOGER UND
ALLOGENER T-ZELLEN
DURCH MCMV-INFIZIERTE DCS
.114
V.3.3.B PHAENOTYPISCHE UNDFUNKTIONELLE BEEINFLUSSUNG UMLIEGENDER DCS
DURCH
MCMV-INFIZIERTE DCS.116
V.3.4 KONTROLLE DER CMV-INFEKTION TROTZ VIRALER
IMMUNEVASIONSSTRATEGIEN.117
VI LITERATURVERZEICHNIS_119
VH ABKUERZUNGEN_149
VM PUBLIKATIONEN_151
IX DANKSAGUNG_ 152
X LEBENSLAUF_153
3 |
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