Charakterisierung der Rolle und Funktion der Protein-Tyrosin-Phosphatase Meg2:
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2003
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INHALTSVERZEICHNIS
I
1
EINLEITUNG_
\
1.1 PROTEIN-TYROSIN-PHOSPHATASEN
L
1.1.1 REZEPTOR-AEHNLICHE PROTEIN-TYROSIN-PHOSPHATASEN 3
1.1.2 INTRAZELLULAERE PROTEIN-TYROSIN-PHOSPHATASEN 5
1.2 PROTEIN-TYROSIN-KINASEN 7
1.2.1 REZEPTOR-TYROSIN-KINASEN 7
1.2.2 INTRAZELLULAERE TYROSIN-KINASEN 8
1.3 MAP-KINASE (MAPK)-KASK
ADEN 9
1.4 REGULATION DER SPEZIFITAET UND AKTIVITAET VON PROTEIN-TYROSIN-
PHOSPHATASEN 10
1.5 BIOLOGISCHE FUNKTION VON PROTEIN-TYROSIN-PHOSPHATASEN
LL
1.5.1 REGULATION VON REZEPTOR-TYROSIN-KINASEN UND MITOGENER
SIGNALTRANSDUKTION 12
1.5.2 REGULATION VON ZELLADHAESION UND ZELLMIGRATION 13
1.5.3 ROLLE VON PROTEIN-TYROSIN-PHOSPHATASEN BEI DER TUMORENTSTEHUNG
15
1.6 ZIELSETZUNG 16
2
MATERIAL UND METHODEN_18
2.1 BEZUGSQUELLEN 18
2.1.1 CHEMIKALIEN 18
2.1.2 ENZYME 19
2.1.3 RADIOCHEMIKALIEN 19
2.1.4 YYKITS" UND SONSTIGES 19
2.1.5 WACHSTUMSFAKTOREN UND LIGANDEN 20
2.1.6 MEDIEN UND PUFFER 20
2.1.7 ZELLKULTURMEDIEN 21
2.1.8 STAMMLOESUNGEN UND HAEUFIG VERWENDETE PUFFER 21
2.1.9 BAKTERIENSTAEMME, ZELLLINIEN UND ANTIKOERPER 22
2.1.9.1 BAKTERIENSTAEMME 23
2.1.9.2 ZELLLINIEN 23
2.1.9.3 ANTIKOERPER 24
2.1.10 PLASMIDE UND OLIGONUKLEOTIDE 25
BIBLIOGRAFISCHE INFORMATIONEN
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INHALTSVERZEICHNIS
II
2.1.10.1 AUSGANGSVEKTOREN 25
2.1.10.2 IM RAHMEN DIESER ARBEIT VERWENDETE PLASMIDE 26
2.1.10.3 WICHTIGE OLIGONUKLEOTIDE
27
2.2 MOLEKULARBIOLOGISCHE METHODEN 28
2.2.1
PLASMIDPRAEPARATION FUER ANALYTISCHE ZWECKE 28
2.2.2
PLASMIDPRAEPARATION FUER PRAEPARATIVE ZWECKE . 28
2.2.3
ENZYMATISCHE BEHANDLUNG VON DNA 29
2.2.3.1 VERDAU VON DNA-FRAGMENTEN MIT RESTRIKTIONSENDONUKLEASEN 29
2.2.3.2 DEPHOSPHORYLIERUNG VON 5'-ENDEN 29
2.2.3.3 VERKNUEPFUNG VON DNA-FRAGMENTEN MIT T4-DNA-LIGASE 29
2.2.4
GELELEKTROPHORESE VON DNA 29
2.2.5
ISOLIERUNG VON DNA-FRAGMENTEN - 29
2.2.6
DNA-TRANSFER IN /LCO/T-BAKERIEN 30
2.2.6.1 HERSTELLUNG KOMPETENTER E. COLI-BAKTERIEN 30
2.2.6.2 TRANSFORMATION VON KOMPETENTEN E. COLI-BAKTERIEN 30
2.2.6.3 DAUERKULTUREN VON E. COLI-BAKTERIEN 30
2.2.7
GEZIELTE MUTAGENESE VON DNA 30
2.2.7.1 HERSTELLUNG VON URACILHALTIGER, EINZELSTRAENGIGER PCDNA3-DNA 30
2.2.7.2 SYNTHESE DES MUTIERTEN STRANGES 31
2.2.8
SEQUENZIERUNG 31
2.2.9
ARBEITEN MIT RNA 31
2.2.9.1 PRAEPARATION VON TOTAL-RNA 31
2.2.9.2 PRAEPARATION VON POLYA
+-RNA (MRNA) AUS TOTAL-RNA 32
2.2.9.3 ELEKTROPHORETISCHE AUFTRENNUNG VON RNA 32
2.2.9.4 NORTHERN-ANALYSE 32
2.2.9.5 TRANSFER VON RNA AUF EINE NITROZELLULOSEMEMBRAN ' 33
2.2.9.6 HYBRIDISIERUNG RADIOAKTIV MARKIERTER PROBEN MIT RNA 33
2.2.9.7 SYNTHESE VON CDNA 33
2.2.10
RADIOAKTIVE MARKIERUNG VON DNA-FRAGMENTEN MIT [A-32P]-DATP 34
2.2.11
LIGHT CYCLER REAL TIME PCR 34
2.2.12
CDNA-FILTERHYBRIDISIERUNG 34
2.2.13
AMPLIFIKATION VON DNA-FRAGMENTEN DURCH PCR 35
2.3 METHODEN ZUR ARBEIT MIT EUKARYONTISCHEN ZELLEN 36
2.3.1
ALLGEMEINE ZELLKULTURTECHNIKEN 36
INHALTSVERZEICHNIS
III
2.3.2 MYKOPLASMENTEST 36
2.3.3
KALZIUMPHOSPHAT-TRANSFEKTION 37
2.3.4 TRANSFEKTION MIT ANDEREN METHODEN 37
2.3.5 BESTIMMUNG DER TRANSFEKTIONSEFFIZIENZ 37
2.3.6 RETROVIRALER GENTRANSFER IN SAEUGERZELLEN 37
2.3.7 RADIOAKTIVE MARKIERUNG VON ZELLEN 38
2.4 PROTEINANALYTISCHE METHODEN 38
2.4.1
EXPRESSION UND AUFREINIGUNG VON GLUTATHION-S-TRANSFERASE
(GST)-
FUSIONSPROTEINEN 38
2.4.1.1 EXPRESSION VON GST-FUSIONSPROTEINEN IN E. COLI BL21 38
2.4.1.2 AFFINITAETSCHROMATOGRAPHIE MIT GLUTATHION-SEPHAROSE 39
2.4.2
TRITON
X-100
LYSE VON ZELLEN
39
2.4.3
ZELLFRAKTIONIERUNG 39
2.4.4 PROTEINBESTIMMUNG 40
2.4.5
IMMUNPRAEZIPITATION VON PROTEINEN 40
2.4.6 PRAEZIPITATION VON ZELLLYSATEN MIT GST-FUSIONSPROTEINEN 40
2.4.7
SDS-POLY
ACRYLAMID-GELELEKTROPHORESE 41
2.4.8 FAERBEN UND FIXIEREN VON POLYACRYLAMID-GELEN 41
2.4.9 TRANSFER VON PROTEINEN AUF NITROZELLULOSEMEMBRAN (WESTERN-BLOT) 41
2.4.10
IMMUNDETEKTION (IMMUNOBLOT-ANALYSE) 41
2.4.11
YYFAR WESTERN PROTEIN OVERLAY"
42
2.4.12
ANALYSE DER PHOSPHATASEAKTIVITAET IN VITRO MITTELS PNPP-TEST ,
42
2.4.13 ANALYSE VON PROTEIN/LIPID-INTERAKTIONEN
IN VITRO (YYPROTEIN-LIPID-OVERLAY")
43
2.4.14 YYGAP-ASSAY" 43
2.5 ZELLBIOCHEMISCHE UND -BIOLOGISCHE UNTERSUCHUNGEN 44
2.5.1 STIMULATION VON ZELLEN 44
2.5.2
IMMUNFLUORESZENZMIKROSKOPIE
44
2.5.3 PHOTOMETRISCHE BESTIMMUNG VON LEBENDEN ZELLEN (MTT-TEST)
44
2.5.4
FOCUSBILDUNGSTEST
45
2.5.5 GEZIELTE INHIBIERUNG DER GENEXPRESSION MITTELS SIRNAS (YYRNA
INTERFERENCE") 45
2.6 HERSTELLUNG VON ANTIKOERPERN 46
2.6.1
POLYKLONALE ANTIKOERPER AUS KANINCHEN
46
INHALTSVERZEICHNIS
IV
2.6.2 MONOKLONALE ANTIKOERPER AUS RATTE 46
3 ERGEBNISSE_ 48
3.1 HERSTELLUNG VERSCHIEDENER GST-MEG2 FUSIONSPROTEINE UND MEG2-
SPEZIF1SCHER ANTIKOERPER 48
3.2 VERBREITUNG UND VORKOMMEN 50
3.2.1
EXPRESSION VON PTP-MEG2 IN VERSCHIEDENEN ZELLLINIEN 50
3.2.1.1 EXPRESSION VON PTP-MEG2 AUF MRNA-EBENE 51
3.2.1.2 EXPRESSION VON PTP-MEG2 AUF PROTEINEBENE 53
3.2.2
INTRAZELLULAERE LOKALISATION VON PTP-MEG2 54
3.3 REGULATION DER EXPRESSION UND AKTIVITAET VON PTP-MEG2 57
3.3.1 DIE EXPRESSION DER
PTP-MEG2 KANN DURCH DIFFERENZIERUNGSAGENZIEN
BEEINFLUSST WERDEN 57
3.3.2 UNTERSUCHUNG DER MEG2-PHOSPHATASEAKTIVITAET MIT REKOMBINANTEN
PROTEINEN 58
3.3.3 DIE MEG2-PHOSPHATASEAKTIVITAET KANN DURCH STIMULI REGULIERT WERDEN
59
3.3.4 PTP-MEG2 BINDET AN PHOSPHOLIPIDE UND KANN DADURCH AKTIVIERT WERDEN
60
3.3.5
PTP-MEG2 WIRD UNTER BESTIMMTEN BEDINGUNGEN MODIFIZIERT 63
3.4 ASSOZIIERTE PROTEINE UND SUBSTRATE 65
3.4.1
PTP-MEG2 ASSOZIIERT MIT DEM EGF-REZEPTOR IN VITRO 65
3.4.2 PTP-MEG2
BINDET DEN EGF-REZEPTOR NACH DESSEN AKTIVIERUNG 68
3.4.3
DIE CRALBP-DOMAENE DER PTP-MEG2 VERMITTELT NICHT DIE ASSOZIATION MIT DEM
EGF-REZEPTOR
70
3.4.4
KOIMMUNPRAEZIPITATION VON PTP-MEG2 UND EGF-REZEPTOR IN HEK 293-ZELLEN71
3.4.5 DER EGF-REZEPTOR IST KEIN SUBSTRAT DER PTP-MEG2 73
3.4.6
WEITERE MIT PTP-MEG2 ASSOZIIERENDE PROTEINE 75
3.5 BIOLOGISCHE FUNKTION DER PTP-MEG2 76
3.5.1
PTP-MEG2
HAT KEINE GAP-AKTIVITAET BEZUEGLICH RHO-GTPASEN 76
3.5.2 PTP-MEG2
INHIBIERT DIE VON V-ERBB UND DEM EGF-REZEPTOR VERMITTELTE
TRANSFORMATION VON ZELLEN IM FOCUSBILDUNGSTEST
78
3.5.3
PTP-MEG2 HAT KEINEN EINFLUSS AUF DIE ZELLPROLIFERATION 81
3.5.4 PTP-MEG2
ERHOEHT DIE MIGRATION VON ZELLEN IM WUNDHEILUNGSEXPERIMENT 82
3.5.5
ANALYSE DER PTP-MEG2 FUNKTION MITTELS SIRNA 84
3.5.5.1 GENERIERUNG UND TEST PTP- MEG2 SPEZIFISCHER SIRNAS AUF
FUNKTIONALITAET 84
INHALTSVERZEICHNIS
V
3.5.5.2 ANALYSE DER TYROSINPHOSPHORYLIERUNG NACH SIRNA INDUZIERTER
MEG2-DEPLETION 86
3.5.5.3 ANALYSE DER GENEXPRESSION NACH SIRNA INDUZIERTER MEG2-DEPLETION
87
3.6 VERSUCH DER IDENTIFIKATION MIT DEM EGF-REZEPTOR BZW. HER2
ASSOZIIERENDER PROTEIN-TYROSIN-PHOSPHATASEN 91
4
DISKUSSION
_ 94
4.1 VERBREITUNG UND VORKOMMEN 94
4.2 REGULATION DER EXPRESSION UND AKTIVITAET
96
4.3 ASSOZIIERTE PROTEINE UND SUBSTRATE 100
4.4 BIOLOGISCHE FUNKTION 102
4.5 AUSBLICK 108
5
ZUSAMMENFASSUNG _109
6
LITERATURVERZEICHNIS_HO
7
ABKUERZUNGEN_127 |
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