Funktionelle Untersuchung an Genen eines Isoprenoid-, Hopanoidbiosyntheseclusters in Streptomyces coelicolor A3(2):
Gespeichert in:
| 1. Verfasser: | |
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| Format: | Buch |
| Sprache: | German |
| Veröffentlicht: |
Augsburg
[Selbstverl.]
2003
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| Beschreibung: | Zugl.: Tübingen, Univ., Diss., 2003 |
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INHALTSVERZEICHNIS
INHALTSVERZEICHNIS
ABKUERZUNGEN
1
EINLEITUNG
1
13
Z
IELE
DER
A
RBEIT
17
1.1
D
AS
V
ORKOMMEN
VON
H
OPANOIDEN
UND
DEREN
F
UNKTION
1
1.1.1
DIE
SHC
UND
IHRE
FUNKTION
2
1.1.2
ELONGIERTE
HOPANOIDE
3
1.1.3
DIE
SHC
UND
IHRE
STRUKTUR
4
1.1.4
DIE
ISOPENTENYLDIPHOSPHAT
UND
ISOPRENOIDBIOSYNTHESE
6
1.2
G
ENERELLE
E
IGENSCHAFTEN
DER
G
ATTUNG
S
TREPTOMYCES
8
1.2.1
STREPTOMYCETEN
UND
IHRE
ENTWICKLUNG
9
1.2.2
DIFFERENZIERUNG
UND
SEKUNDAERMETABOLISMUS
DER
STREPTOMYCETEN
11
1.2.3
ENTDECKUNG
DES
PUTATIVEN
SQUALEN-HOPEN-CYCLASE-GENS
IM
STREPTOMYCES
12
1.2.4
COELICOLOR
ML
45
CHROMOSOM
DELETION
PUTATIVER
HOPANOID-BIOSYNTHESEGENE
IN
STREPTOMYCES
12
1.2.5
COELICOLOR
ML
45
GENETIK
DER
STREPTOMYCETEN
14
1.2.6
KLONIERUNGS-,
INTEGRATIONS-,
DISRUPTIONS
UND
RESISTENZVERMITTELNDE
VEKTOREN
FUER
STREPTOMYCETEN
16
2
MATERIAL
UND
METHODEN
19
2.1
M
ATERIAL
19
2.1.1
BAKTERIENSTAEMME
19
2.1.2
PLASMIDE
19
2.1.3
OLIGONUKLEOTIDE
21
2.1.4
KULTURMEDIEN
23
2.1.5
PUFFER
24
2.1.6
ANTIBIOTIKA
25
2.1.7
LOESUNGEN
ZUR
NACHWEISREAKTION
DER
SS-GALAKTOSIDASE
BEI
ESCHERICHIA
COLI
25
2.1.8
ENZYME
25
2.1.9
CHEMIKALIEN
UND
MATERIALIEN
26
2.1.10
GERAETE
27
2.1.11
COMPUTERPROGRAMME
28
2.2
M
ETHODEN
28
2.2.1
KULTURBEDINGUNGEN:
ANZUCHT
UND
KULTIVIERUNG
28
2.2.1.1
ESCHERICHIA
COLI
28
2.2.1.2
STREPTOMYCES
SP.
29
2.2.2
STAMMHALTUNG
29
2.2.2.1
ESCHERICHIA
COLI
29
2.2.2.2
STREPTOMYCES
SP.
30
2.2.2.2.1
SPORENISOLIERUNG
VON
STREPTOMYCES
SP.
30
2.2.3
DNA-ISOLIERUNG
31
2.2.3.1
ISOLIERUNG
VON
PLASMID-DNA
AUS
ESCHERICHIA
COLI
31
INHALTSVERZEICHNIS
2.2.3.1.1
SCHNELLES
SCREENING
VON
REKOMBINANTEN
PLASMIDEN
AUS
ESCHERICHIA
COLI
31
2.2.3.1.2
NUCLEOBOND*AX
100
DNA
ISOLIERUNG
(MACHEREY-NAGEL)
32
2.2.3.1.3
E.Z.N.A.
PLASMID
MINIPREP
KIT
II
(PEQLAB)
33
2.2.3.2
ISOLIERUNG
VON
DNA
AUS
STREPTOMYCES
SP.
34
2.2.3.2.1
PLASMIDISOLIERUNG
AUS
STREPTOMYCETEN
/
MINI-LYSE
(MODIFIZIERT
NACH
KIESER,
1984)
34
2.23.2.2
ISOLIERUNG
VON
GESAMT-DNA
AUS
STREPTOMYCETEN
(NACH
ALTENBUCHNER
UND
CULLUM,
35
1984)
2.2.4
AUFREINIGUNG
VON
DNA
36
2.2.4.1
DEPROTEINIERUNG
DURCH
PHENOLEXTRAKTION
36
2.2.4.2
ETHANOL
UND
ISOPROPANOLFAELLUNG
37
2.2.4.3
PRAEPARATIVES
AGAROSEGEL
38
2.2.4.4
GELELUTION
MIT
DEM
QIAQUICK
GEL
EXTRACTION
KIT
(QIAGEN)
38
2.2.5
CHARAKTERISIERUNG
VON
DNA
39
2.2.5.1
RESTRIKTIONSANALYSE
39
2.2.5.2
DNA-AGAROSEGELELEKTROPHORESE
40
2.2.5.3
MOLEKULARGEWICHTSSTANDARD
FUER
DIE
GELELEKTROPHORESE
41
2.2.6
KONZENTRATIONSBESTIMMUNG
VON
DNA
41
2.2.7
POLYMERASE
KETTENREAKTION
(PCR
=
YYPOLYMERASE
CHAIN
REACTION
"
)
41
2.2.7.1
YYNESTED
"
PCR
42
2.2.7.2
AUFREINIGUNG
DES
PCR-PRODUKTS
MIT:
QIAQUICK
PCR
EXTRACTION
KIT
(QIAGEN)
43
2.2.8
HYBRIDISIERUNG
NACH
SOUTHERN
(1975)
44
2.2.8.1
DNA
TRANSFER
(VAKUUMBLOTTING)
&
AUFBAU
45
2.2.8.2
MARKIERUNG
DER
SONDE
46
2.2.8.3
DNA-DNA-HYBRIDISIERUNG
46
2.2.8.4
NACHWEISREAKTION
47
2.2.9
KLONIERUNG
UND
LIGATION
48
2.2.10
TRANSFORMATION
48
2.2.10.1
HERSTELLUNG
KOMPETENTER
ESCHERICHIA
CO/I-ZELLEN (COHEN
ET
AL.,
1972)
49
2.2.10.2
TRANSFORMATION
KOMPETENTER
ESCHERICHIA
CO/I-ZELLEN
(MORRISON,
1979)
49
2.2.10.3
KLONIERUNG
MIT
TOPOISOMERASE
(INVITROGEN)
50
2.2.10.3.1
ZERO
BLUNTTOPO
PCR
KLONIERUNG
UND
TRANSFORMATION
(INVITROGEN)
50
2.2.10.3.2
TOPO
TA
KLONIERUNG
FUER
SEQUENZIERUNG
(INVITROGEN)
51
2.2.10.4
HERSTELLUNG
VON
STREPTOMYCETEN-PROTOPLASTEN
52
2.2.10.5
TRANSFORMATION
VON
STREPTOMYCETEN
PROTOPLASTEN
(KIESER
ET
AL.,
1982)
53
2.2.11
SELEKTIONSMOEGLICHKEITEN
54
2.2.11.1
ANTIBIOTIKARESISTENZ
54
2.2.11.2
BLAU/WEISS-SELEKTION
54
2.2.12
LIPID-ANALYSE
55
2.2.12.1
LIPIDEXTRAKTION
BEI
STREPTOMYCES
COELICOLOR
55
2.2.12.2
HOPANOIDAUFARBEITUNG
FUER
DIE
GASCHROMATOGRAPHIE (NACH
ROHRNER)
56
2.3
R
EDIRECT
YY:
PCR
T
ARGETING
-S
YSTEM
IN
S
TREPTOMYCES
57
COELICOLOR
A3(2)
2.3.1
EINLEITUNG
57
2.3.2
AUFREINIGUNG
DES
PCR
TEMPLATES
[RESISTENZ
(-ORIT)
KASSETTE]
60
2.3.3
KONSTRUKTION
DER
LANGEN
PCR
PRIMER
61
2.3.4
PCR
AMPLIFIKATION
DER
VERLAENGERTEN
RESISTENZKASSETTE
62
2.3.5
EINFUEHRUNG
DES
STREPTOMYCES
COELICOLOR
COSMID
KLONS
IN
ESCHERICHIA
COLI
63
BW25
11
3/PIJ790
(AE-RED
REKOMBINATIONSPLASMID)
DURCH
ELEKTROPORATION
2.3.6
PCR
YYTARGETING
"
DES
STREPTOMYCES
COELICOLOR
COSMIDS
64
2.3.7
TRANSFER
DES
MUTANTEN
COSMIDS
NACH
STREPTOMYCES
68
INHALTSVERZEICHNIS
3
ERGEBNISSE
73
3.1
N
ACHWEIS
DES
S
QUALEN
-H
OPEN
-C
YCLASE
-G
ENS
IN
S
TREPTOMYCETEN
73
UND
VERWANDTEN
GRUPPEN
3.1.1.
DNA
ALIGNMENT
ZUR
KONSTRUKTION
DER
NACHWEISPRIMER
73
3.1.2.
PCR
UND
KLONIERUNG
DER
PCR-FRAGMENTE
74
3.1.3
SEQUENZIERUNG
UND
ALIGNMENT
DER
PCR-FRAGMENTE
80
3.2
H
ERSTELLUNG
EINER
S
QUALEN
-H
OPEN
-C
YCLASE
D
ELETIONSMUTANTE
87
IN
STREPTOMYCES
COELICOLOR
M145
3.2.1
HERSTELLUNG
DES
DELETIONSVEKTORS
87
3.2.1.1
KLONIERUNG
DES
A-FRAGMENTS
88
3.2.1.2
KLONIERUNG
DES
B-FRAGMENTS
89
3.2.1.3
KONSTRUKTION
DES
DELETIONSVEKTORS
PSLE61AB+PGMLL
93
3.2.2
ERZEUGUNG
EINER
STREPTOMYCES
COELICOLOR
SQUALEN-HOPEN-CYCLASE
95
DELETIONSMUTANTE
MIT
PSLEOEL
ABPGML
1/B
3.2.3
GENETISCHER
NACHWEIS
DER
DELETION
DES
PUTATIVEN
SQUALEN-HOPEN
95
CYCLASE-GENS
IN
STREPTOMYCES
COELICOLOR
ML
45
3.2.4
BIOCHEMISCHER
NACHWEIS
DER
DELETION
DES
PUTATIVEN
SQUALEN-HOPEN
98
CYCLASE-GENS
IN
STREPTOMYCES
COELICOLOR
ML
45
3.2.5
PHAENOTYPISCHE
CHARAKTERISIERUNG
DER
STREPTOMYCES
COELICOLOR
ML
45
101
SQUALEN-HOPEN-CYCLASE-MUTAIITE
3.2.6
BIOCHEMISCHE
CHARAKTERISIERUNG
VON
STREPTOMYCES COELICOLOR
102
ML
45
IN
FLUESSIGMEDIUM
+
NACL
3.3
KOMPLEMENTATION
DER
STREPTOMYCES
COELICOLOR
M145
SQUALEN-HOPEN
103
CYCLASE-MUTANTE
3.3.1
AMPLIFIKATION
DES
STREPTOMYCES
COELICOLOR
ML
45
SQUALEN-HOPEN
103
CYCLASE-FRAGMENTS
3.3.2
LIGATION
DES
SQUALEN-HOPEN-CYCLASE-FRAGEMENTS
IN
PCR-BLUNT-H-TOPO
104
3.3.3
LIGATION
DER
SQUALEN-HOPEN-CYCLASE
STROMABWAERTS
VOM
ERME*P
105
PROMOTER
DES
VEKTORS
PEH15
3.3.4
FUSION
DES
VEKTORS
PEH155.COESHC
MIT
DEM
VEKTOR
PSETL
52
107
3.3.5
KOMPLEMENTATION
DER
SQUALEN-HOPEN-CYCLASE-MUTANTE
MIT
DEM
VEKTOR
109
PSETSHC2
3.3.6
BIOCHEMISCHER
NACHWEIS
DER
KOMPLEMENTATION
109
3.3.7
HOPANOIDANALYSE
DER
KOMPLEMENTIERTEN
SQUALEN-HOPEN-CYCLASE
112
MUTANTE
IN
FLUESSIGKULTUR
3.3.8
PHAENOTYPISCHE
CHARAKTERISIERUNG
DER
KOMPLEMENTIERTEN
117
SQUALEN-HOPEN-CYCLASE-MUTANTE
3.4
D
ELETION
PUTATIVER
H
OPANOID
-B
IOSYNTHESEGENE
IN
S
TREPTOMYCES
118
COELICOLOR
ML
45
3.4.1
KONSTRUKTION
DER
MUTANTEN
ORF
8,9
UND
11
119
3.4.2
BIOCHEMISCHE
ANALYSE
DER
ORF
8-MUTANTE
122
3.4.3
BIOCHEMISCHE
ANALYSE
DER
ORF
9-MUTANTE
123
3.4.4
BIOCHEMISCHE
ANALYSE
DER
ORF
11
-MUTANTEN
125
4
DISKUSSION
127
4.1
N
ACHWEIS
DES
S
QUALEN
-H
OPEN
-C
YCLASE
-G
ENS
IN
S
TREPTOMYCETEN
127
UND
VERWANDTEN
GRUPPEN
INHALTSVERZEICHNIS
4.2
DIESTREPTOA/FCESCOEL/COLORSQUALEN-HOPEN-CYCLASEDELETIONS
134
M
UTANTE
33A
4.2.1
ERZEUGUNG
EINER
SQUALEN-HOPEN-CYCLASE-MUTANTE
IN
STREPTOMYCES
COELICOLOR
136
M145
4.2.2
ERZEUGUNG
EINER
STREPTOMYCES
COELICOLOR
SAC-DELETIONSMUTANTE
MIT
DEM
VEKTOR
137
PSLE61ABPGMLL/B
4.2.2.1
GENETISCHER
NACHWEIS
DER
DELETION
DER
PUTATIVEN
SHC
IN
STREPTOMYCES
COELICOLOR
138
M145
4.2.2.2
BIOCHEMISCHER
NACHWEIS
DER
DELETION
DER
PUTATIVEN
SQUALEN-HOPEN-CYCLASE
IN
139
STREPTOMYCES
COELICOLOR
M145
4.2.23
PHAENOTYPISCHE
CHARAKTERISIERUNG
DER
STREPTOMYCES
COELICOLOR
M145
SAC-MUTANTE
139
4.2.3
KOMPLEMENTATION
DER
STREPTOMYCES
COELICOLOR
M
145
SAC-MUTANTE
144
43
D
ELETION
PUTATIVER
H
OPANOID
-B
IOSYNTHESEGENE
IN
148
S
TREPTOMYCES
COELICOLOR
5
ZUSAMMENFASSUNG
153
6
LITERATURVERZEICHNIS
155
7
ANHANG
165
7.1
PCR-P
ROGRAMME
UND
A
NSAETZE
161
7.2
A
LIGNMENTS
162
73
P
LASMIDE
169
7.4
PCR
UND
R
ESTRIKTIONSFRAGMENTE
172
7.5
S
EQUENZIERUNGSERGEBNISSE
172
7.6
UE
BERSICHT
UEBER
DIE
MITTELS
R
ESTRIKTION
ERZEUGTEN
F
RAGMENTE
182
7.7
UE
BERSICHTUEBERDIE
L
IPIDANALYSEN
182 |
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