Untersuchungen zur Rolle der Proteintyrosinphosphatase PTPalpha im Mammakarzinomsystem:
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| Format: | Buch |
| Sprache: | German |
| Veröffentlicht: |
2003
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| Beschreibung: | München, Techn. Univ., Diss., 2003 |
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INHALTSVERZEICHNIS
1. EINLEITUNG I
1.1. SIGNALUEBERTRAGUNG DURCH TYROSINPHOSPHORYLIERUNG 1
1.2. PROTEINTYROSINKINASEN 3
1.2.1. REZEPTORTYROSINKINASEN 3
1.2.2. INTRAZELLULAERE TYROSINKINASEN 4
1.3. PROTEINTYROSINPHOSPHATASEN 6
1.3.1. KLASSIFIZIERUNG DER PTPN 7
1.3.2. DER KATALYSEMECHANISMUS DER PTPN 10
1.3.3. PHYSIOLOGISCHE FUNKTION DER PTPN 11
1.3.4. REGULATION DER PTPN 13
1.3.5. PTPA 16
1.3.6. ZIELSETZUNG 17
2. MATERIAL UND METHODEN
19
2.1. BEZUGSQUELLENNACHWEIS 19
2.1.1. CHEMIKALIEN 19
2.1.2. ENZYME 20
2.1.3. RADIOCHEMIKALIEN 20
2.1.4. LIGANDEN UND WACHSTUMSFAKTOREN 21
2.1.5. "KITS" UND SONSTIGES 21
2.2. MEDIEN UND PUFFER 21
2.2.1. MEDIEN FUER E.COLI BAKTERIEN 21
2.2.2. ZELLKULTURMEDIEN 22
2.2.3. STAMMLOESUNGEN UND PUFFER 22
2.3. BAKTERIENSTAEMME, ZELLINIEN UND ANTIKOERPER 24
BIBLIOGRAFISCHE INFORMATIONEN
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INHALTSVERZEICHNIS
_
2.3.1. BAKTERIENSTAEMME 24
2.3.2. ZELLINIEN 24
23.2.1. ELTEMZELLINIEN
24
23.2.2. VIRUSPRODUZIERENDE ZELLINIEN
26
23.23. STABILE ZELLINIEN
26
2.3.3. ANTIKOERPER 28
2.4. PLASMIDVEKTOREN UND OLIGONUKLEOTIDE 30
2.4.1. AUSGANGSVEKTOREN 30
2.4.2. IM RAHMEN DIESER ARBEIT VERWENDETE VEKTOREN 30
2.4.3. ZUR MUTAGENESE VERWENDETE OLIGONUKLEOTIDE 31
2.5. MOLEKULARBIOLOGISCHE METHODEN 31
2.5.1. PLASMIDPRAEPARATION FUER ANALYTISCHE ZWECKE 31
2.5.2. PLASMIDPRAEPARATION FUER PRAEPARATIVE ZWECKE 31
2.5.3. ENZYMATISCHE BEHANDLUNG VON DNA 31
2.53.1. VERDAU VON DNA-FRAGMENTEN MIT RESTRIKTIONSENDONUKLEASEN
31
2.5.3.2. DEPHOSPHORYLIERUNG VON 5 '-ENDEN
31
2.533. PHOSPHORYLIERUNG VON 5'-ENDEN
31
2.53.4. AUFFUELLEN UEBERHAENGIGER 5'-ENDEN MIT KLENOW-POLYMERASE
31
2.53.5. VERKNUEPFUNG VON DNA-FRAGMENTEN MIT T4-DNA-LIGASE
32
2.5.4. GELELEKTROPHORESE VON DNA 32
2.5.4.1. AUFTRENNUNG VON DNA-FRAGMENTEN IN EINEM AGAROSEGEL
32
2.5.5. ISOLIERUNG VON DNA FRAGMENTEN AUS AGAROSEGELEN 32
2.5.6. DNA-TRANSFER IN
E.COLI
BAKTERIEN 32
2.5.6.1. HERSTELLUNG KOMPETENTER E.COLI BAKTERIEN
32
2.5.6.2. TRANSFORMATION VON KOMPETENTEN E.COLI BAKTERIEN
33
INHALTSVERZEICHNIS
2.5.7. DAUERKULTUREN VON
E.COLI
BAKTERIEN 33
2.5.8. SEQUENZIERUNG VON PLASMID-DNA 33
2.5.9. DNA-MUTAGENESE 33
2.5.9.1. HERSTELLUNG VON URACILHALTIGER EINZELSTRANG M13 DNA
33
2.5.9.2. SYNTHESE DES MUTIERTEN DNA-STRANGES
34
2.6. AMPLIFIKATION VON DNA-FRAGMENTEN DURCH PCR 34
2.6.1. PCR-AMPLIFIKATION VON DNA 34
2.6.2. AUFREINIGUNG VON PCR-PRODUKTEN 35
2.6.3. KLONIERUNG VON PCR-PRODUKTEN 35
2.7. CDNA ARRAYS 35
2.8. PROTEINANALYTISCHE METHODEN
36
2.8.1. LYSE VON ZELLEN MIT TRITON X-100 36
2.8.2. PROTEINBESTIMMUNG 36
2.8.3. IMMUNPRAEZIPITATION VON PROTEINEN 37
2.8.4. SDS-POLYACRYLAMID-GELELEKTROPHORESE 37
2.8.5. FAERBUNG UND FIXIERUNG VON POLYACRYLAMIDGELEN 37
2.8.6. TRANSFER VON PROTEINEN AUF EINE NITROZELLULOSEMEMBRAN 38
2.8.7. IMMUNDETEKTION (WESTEM-BLOT ANALYSE) 38
2.8.8.
IN VITRO
PHOSPHATASEAKTIVITAET GEGENUEBER PNPP 38
2.8.9. C-SRC
IN VITRO
KINASEASSAY 39
2.9. METHODEN ZUR ARBEIT MIT EUKARYONTISCHEN ZELLEN 39
2.9.1. ALLGEMEINE ZELLKULTURTECHNIKEN 39
2.9.2. MYKOPLASMENTEST 40
2.9.3. TRANSFEKTION VON SAEUGERZELLEN 40
2.9.3.1. TRANSFEKTION VON SAEUGERZELLEN MIT KALZIUMPHOSPHAT
40
INHALTSVER7.EICHNIS
2.9.3.2. TRANSFEKTION VON SAEUGERZELLEN MIT DER DOSPER METHODE 41
2.9.3.3. TRANSFEKTION VON SAEUGERZELLEN MIT LIPOFECTAMINE 41
2.9.3.4. BESTIMMUNG DER TRANSFEKTIONSEFFIZIENZ 42
2.9.4. RETROVIRALER GENTRANSFER UND SELEKTION IN SAEUGERZELLEN 42
2.9.5. IMMUNFLUORESZENZ 43
2.9.6. ZELLZAEHLEXPERIMENTE 43
2.9.7. STIMULATION DER DNA-SYNTHESE [(3H)-THYMIDIN-EINBAU] 43
2.9.8. FACS ANALYSE 44
2.9.9. STIMULATION VON ZELLEN 44
3. ERGEBNISSE
45
3.1. CDNA-ARRAY ANALYSE 45
3.1.1. BRUSTKREBSZELLINIEN 47
3.1.2. PRIMAERES BRUSTGEWEBE 48
3.2. CDNA-ARRAY VALIDIERUNG 52
3.2.1. MRNA EXPRESSION 52
3.2.2. PROTEIN EXPRESSION 52
3.3. FUNKTIONELLE UNTERSUCHUNGEN ZU PTP
54
3.3.1. OPTIMIERUNG DES TETRAZYKLIN-INDUZIERBAREN EXPRESSIONSSYSTEMS 55
3.3.2. RETROVIRALES TETRAZYKLIN-INDUZIERBARES GENEXPRESSIONSSYSTEM 56
3.3.3. ERZEUGUNG TRANSAKTIVATOR-STABILER BRUSTZELLINIEN 59
3.3.4. ERZEUGUNG INDUZIERBAR EXPRIMIERENDER PTPA-BRUSTZELLINIEN 61
3.3.5. CHARAKTERISIERUNG INDUZIERBAR EXPRIMIERENDER PTPA-BRUSTZELLINIEN
62
3.4. FUNKTIONSANALYSE VON PTPA IN MAMMAKARZINOMZELLINIEN
67
3.4.1. PROLIFERATIONSASSAYS 67
3.4.2. FACS-ANALYSE
69
INHALTSVERZEICHNIS
3.4.3. CDNA-ARRAY-ANALYSEN 70
3.4.3.1. GENREGULATION NACH TTA-INDUKTION
71
3.4.3.2. GENREGULATION NACH PTPA-INDUKTION
72
3.4.3.3. GRUPPIEREN DER GENE AUF DER BASIS IHRER EXPRESSIONSDATEN
("CLUSTER")
74
3.4.4. C-SRC AKTIVITAET 77
3.4.5. DER EINFLUSS VON PTPA AUF DEN IGF-1 SIGNALWEG 78
4. DISKUSSION
82
4.1. CDNA-ARRAY ANALYSE 83
4.2. CDNA-ARRAY VALIDIERUNG 84
4.3. FUNKTIONELLE UNTERSUCHUNGEN ZU PTPA 85
4.3.1. OPTIMIERUNG DES TETRAZYKLIN-INDUZIERBAREN EXPRESSIONSSYSTEMS 85
4.3.2. RETROVIRALES TETRAZYKLIN-INDUZIERBARES GENEXPRESSIONSSYSTEM 87
4.3.3. ERZEUGUNG TRANSAKTIVATOR-STABILER BRUSTZELLINIEN 88
4.3.4. ERZEUGUNG INDUZIERBAR EXPRIMIERENDER PTPA-BRUSTZELLINIEN 89
4.3.5. CHARAKTERISIERUNG INDUZIERBAR EXPRIMIERENDER PTPA-BRUSTZELLINIEN
90
4.4. FUNKTIONSANALYSE VON PTPA IN MAMMAKARZINOMZELLINIEN
93
5. ZUSAMMENFASSUNG 99
6
LITERATUR
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