Neutralisierung eines Inhibitors der neuronalen Regeneration im ZNS: Optimierung des anti-Nogo-A Antikörpers IN-1 durch Protein Engineering
Gespeichert in:
| 1. Verfasser: | |
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| Format: | Buch |
| Sprache: | German |
| Veröffentlicht: |
2003
|
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INHALTSVERZEICHNIS
_
I
INHALTSVERZEICHNIS
1
EINLEITUNG
.
1
1.1
STRUKTUR
UND
FUNKTION
VON
ANTIKOERPERN
.
1
1.2
GENTECHNISCHE
HERSTELLUNG
VON
ANTIKOERPERFRAGMENTEN
UND
DEREN
EINSATZ
IN
DIAGNOSTIK
UND
THERAPIE
.
3
1.3
DEGENERATION
UND
REGENERATION
VON
NEURONEN
IM
ZENTRALEN
NERVENSYSTEM
(ZNS)
HOEHERER
VERTEBRATEN
.
6
1.3
NEUTRALISIERUNG
DES
NEURONALEN
INHIBITORPROTEINS
NOGO-A
(BZW.
NI-220)
DURCH
DEN
MONOKLONALEN
ANTIKOERPER
IN
1
.
8
1.4
ZIELSETZUNG
DIESER
ARBEIT
.
13
2
MATERIAL
UND
METHODEN
_
.
_
.
_
.
_
.
_
_
14
2.1
MATERIAL
.
14
2.1.1
BIOLOGISCHES
MATERIAL
.
14
2.1.2
PLASMIDE
.
14
2.1.3
OLIGODESOXYNUKLEOTIDE
.
15
2.1.4
ENZYME
UND
SONSTIGE
PROTEINE
.
18
2.1.5
CHEMIKALIEN
.
19
2.1.6
STANDARDS
UND
KITS
.
23
2.1.7
GERAETE
.
24
2.1.8
VERBRAUCHSMATERIAL
.
28
2.1.9
PUFFER,
MEDIEN
UND
STAMMLOESUNGEN
.
31
2.2
MOLEKULARBIOLOGISCHE
METHODEN
.
36
2.2.1
KULTIVIERUNG
UND
KONSERVIERUNG
VON
ESCHERICHIA
COFR-STAEMMEN
.
36
2.2.2
ISOLIERUNG
VON
DNA
AUS
E.
COLI
.
37
2.2.2.1
ISOLIERUNG
VON
CHROMOSOMALER
DNA
.
37
2.2.2.2
ISOLIERUNG
VON
DOPPELSTRAENGIGER
PLASMID-DNA
.
37
2.2.2.3
ISOLIERUNG
VON
EINZELSTRAENGIGER
PLASMID-DNA
.
38
2.2.3
TRANSFORMATION
VON
E.
COLI
MIT
PLASMID-DNA
.
39
2.2.4
GELELEKTROPHORESE
UND
REINIGUNG
VON
DNA
.
40
2.2.4.1
ANALYTISCHE
AGAROSE-GELELEKTROPHORESE
.
40
2.2.4.2
PRAEPARATIVE
AGAROSE-GELELEKTROPHORESE
UND
ISOLIERUNG
VON
DNA-FRAGMENTEN
.
40
2.2.4.3
DENATURIERENDE
POLYACRYLAMID/HAMSTOFF-GELELEKTROPHORESE
.
41
2.2.5
REINIGUNG
VON
OLIGODESOXYNUKLEOTIDEN
.
42
2.2.6
ABTRENNUNG
VON
ENZYMEN
(PHENOL-EXTRAKTION,
ETHANOL-FAELLUNG)
.
43
H
INHALTSVERZEICHNIS
2.2.7
ENZYMATISCHE
MODIFIZIERUNG
VON
DNA
.
44
2.2.7.1
SPALTUNG
MIT
RESTRIKTIONSENDONUKLEASEN
.
44
2.2.7.2
LIGIERUNG
VON
DNA-FRAGMENTEN
.
44
2.2.7.3
PHOSPHORYLIERUNG
UND
DEPHOSPHORYLIERUNG
VON
DNA
FRAGMENTEN
.
45
2.2.7.4
ORTSGERICHTETE
MUTAGENESE
NACH
KUNKEL
.
45
2.2.7.5
POLYMERASE-KETTENREAKTION
(PCR)
ZUR
AMPLIFIZIERUNG
BZW.
SYNTHESE
VON
GENEN
.
46
2.2.8
SEQUENZIERUNG
DOPPELSTRAENGIGER
DNA
.
48
2.2.8.1
RADIOAKTIVE
SEQUENZANALYSE
.
48
2.2.8.2
AUTOMATISIERTE
SEQUENZANALYSE
UNTER
VERWENDUNG
FLUORES
ZIERENDER
TERMINATOREN
.
48
2.3
GENTECHNISCHE
METHODEN
.
49
2.3.1
PRODUKTION
REKOMBINANTER
PROTEINE
IN
E.
COLI
.
49
2.3.1.1
ANZUCHT,
INDUKTION
UND
ERNTE
VON
E.
COZZ-KULTUREN
IM
SCHUETTEL
KOLBEN
.
49
2.3.1.2
ANZUCHT,
INDUKTION
UND
ERNTE
VON
E.
COZZ-KULTUREN
IM
LABOR
FERMENTER
.
50
2.3.2
KOLONIE-FILTERSTAPEL-ASSAY
ZUR
SELEKTION
VON
VARIANTEN
DES
IN-1
FAT
FRAGMENTS
.
52
2.4
PROTEINCHEMISCHE
METHODEN
.
54
2.4.1
CHROMATOGRAPHISCHE
VERFAHREN
.
54
2.4.1.1
PROTEINREINIGUNG
DURCH
STREPTAVIDIN-AFFINITAETSCHROMATOGRAPHIE
.
54
2.4.1.2
PROTEINREINIGUNG
DURCH
IMMOBILISIERTE
METALLCHELAT-AFFINITAETS
CHROMATOGRAPHIE
(IMAC)
.
55
2.4.1.2.1
IMAC
UNTER
VERWENDUNG
EINER
ZN(II)/IDA
SEPHAROSEMATRIX
.
55
2.4.1.2.2
IMAC
AN
EINER
ZN(II)/POROS-MATRIX
UNTER
FPLC
BEDINGUNGEN
.
56
2.4.1.3
PROTEINREINIGUNG
DURCH
THIOPHILE
ADSORPTIONS-CHROMATOGRA
PHIE
(TAC)
.
57
2.4.2
SDS-POLYACRYLAMID-GELELEKTROPHORESE
(SDS-PAGE)
.
57
2.4.3
BESTIMMUNG
VON
PROTEINKONZENTRATIONEN
DURCH
ABSORPTIONSMESSUNG
BEI
280
NM
.
59
2.4.4
KONZENTRIERUNG
VON
PROTEINEN
.
59
2.4.5
ORTSGERICHTETE
KOPPLUNG
VON
F
A
B-FRAGMENTEN
MIT
FLUORESCEIN-5
MALEIMID
.
60
2.5
IMMUNCHEMISCHE
METHODEN
.
60
INHALTSVERZEICHNIS
HI
2.5.1
WESTEM-BLOTTING
.
60
2.5.2
BINDUNGSNACHWEIS
MITTELS
ENZYME-LINKED
IMMUNOSORBENT
ASSAY
(ELISA)
.
61
2.5.3
NACHWEIS
VON
BINDUNGSAKTIVITAET
DURCH
OBERFLAECHEN-PLASMONRESONANZ
(SURFACE
PLASMON
RESONANCE,
SPR)
MIT
DEM
BIACORE-SYSTEM
.
63
2.6
HISTOLOGISCHE
METHODEN
.
66
2.7
ENZYMKINETISCHE
METHODEN
.
67
2.8
VERWENDETE
COMPUTERPROGRAMME
UND
DATENBANKEN
.
68
3
ERGEBNISSE
.
70
3.1
BAKTERIELLE
PRODUKTION,
REINIGUNG
UND
IN
VIVO-EINSATZ
DES
REKOMBINANTEN
IN-1
FAB-FRAGMENTS
.
70
3.1.1
OPTIMIERUNG
DES
FERMENTATIONSVERFAHRENS
ZUR
HERSTELLUNG
EINES
PARTIELL
HUMANISIERTEN
IN-1
F
AB
-FRAGMENTS
IN
E.
COLI
UNTER
MINIMIERUNG
DES
PLASMIDVERLUSTES
IN
DER
FERMENTATIONSKULTUR
.
71
3.1.1.1
ERHOEHUNG
DER
SELEKTIONSSTRINGENZ
MITTELS
ERSATZ
DES
AMPICILLIN
DURCH
EIN
CHLORAMPHENICOL-RESISTENZGEN
.
73
3.1.1.2
KONSTRUKTION
UND
VERWENDUNG
DES
VEKTORS
PMFL
ZUR
PROBA
KOMPLEMENTIERUNG
VON
E.
COLI
JM83
.
74
3.1.2
ENTWICKLUNG
EINES
REINIGUNGSVERFAHRENS
FUER
REKOMBINANTE
F,B-FRAGMEN
TE
OHNE
DIE
NOTWENDIGKEIT
EINES
AFFINITAETSANHAENGSELS
.
81
3.1.3
EINSATZ
DES
REKOMBINANTEN
IN-1
F
A
B-FRAGMENTS
ZUM
STUDIUM
DER
NEURONALEN
REGENERATION
IN
VIVO
.
85
3.1.4
KONSTRUKTION
VON
PASK106-INL
UND
HERSTELLUNG
EINER
FUSION
AUS
DEM
IN-1
F
A
B-FRAGMENT
UND
DER
ALBUMINBINDENDEN
DOMAENE
VON
STREPTO
COCCUS
PROTEIN
G
.
86
3.2
HERSTELLUNG
FUNKTIONELLER
FRAGMENTE
DES
NEURONALEN
INHIBITORPROTEINS
NOGO-A
IN
E.
COLI
.
88
3.2.1
KONSTRUKTION
VON
PASKI
LL-NIFR2
UND
GEWINNUNG
EINES
VERKUERZTEN
FRAGMENTS
DER
ZENTRALEN
GLOBULAEREN
DOMAENE
VON
NOGO-A
.
88
3.2.2
OPTIMIERUNG
DER
GENTECHNISCHEN
PRODUKTION
UND
REINIGUNG
DES
LOESLICHEN
NOGO-A
FRAGMENTS
.
91
3.3
OPTIMIERUNG
DER
ANTIGENBINDUNG
DES
REKOMBINANTEN
IN-1
F
A
B-FRAGMENTS
DURCH
MOLECULAR
MODELLING
UND
EVOLUTIVES
PROTEIN-DESIGN
.
93
3.3.1
MODELLIERUNG
DES
IN-1
PARATOPS
AUF
GRUNDLAGE
DER
3D-STRUKTUREN
DER
F
AB
-FRAGMENTETR1.9
UND
36-71
.
94
3.3.2
VERIFIZIERUNG
DER
GUELTIGKEIT
DES
LVGE/6FAB
MODELLS
DURCH
ORTSGERICHTETE
MUTAGENESE
IN
DER
IN-1
ANTIGEN-BINDUNGSSTELLE
.
96
IV
INHALTSVERZEICHNIS
3.3.3
SCHRITTWEISE
AFFINITAETSMATURIERUNG
DES
IN-1
F,B-FRAGMENTS
DURCH
ZU
FALLSMUTAGENESE
DES
CDR-L3
.
99
3.3.4
FUNKTIONELLE
ANALYSE
DER
AFFINITAETSMATURIERTEN
VARIANTEN
DES
IN-1
F,B
FRAGMENTS
.
112
3.4
NACHWEIS
DER
BINDUNGS
UND
NEUTRALISIERUNGSAKTIVITAET
DER
AFFINITAETSMATURIERTEN
VARIANTEN
DES
IN-1
FAB-FRAGMENTS
GEGENUEBER
NOGO-A
.
114
3.4.1
AFFINITAETSANALYSE
DER
MUTIERTEN
IN-1
F
A
B-FRAGMENTE
MIT
NOGO-A
UND
DESSEN
REKOMBINANTEN
FRAGMENTEN
IM
ELISA
.
115
3.4.2
BESTIMMUNG
DER
BINDUNGSKONSTANTE
DES
IN-1
F
A
B-FRAGMENTS
UND
SEINER
MUTANTE
II.
1.8
FUER
DAS
NOGO-A
FRAGMENT
NIFR4
MITTELS
OBERFLAECHEN
PLASMONRESONANZ
.
117
3.4.3
ANALYSE
DER
ANTIGENERKENNUNG
DURCH
DAS
IN-1
F
A
B-FRAGMENT
UND
SEINER
MUTANTEN
AN
GEWEBESCHNITTEN
ADULTER
RATTEN
.
122
3.4.4
UNTERSUCHUNGEN
ZUR
NEUTRALISIERUNG
DER
INHIBITORISCHEN
WIRKUNG
VON
NOGO-A
DURCH
DIE
MUTANTEN
DES
IN-1
F
A
B-FRAGMENTS
MITTELS
ZELLKULTUR
ASSAY
.
125
3.5
HUMANISIERUNG
DER
VARIANTE
II.1.8
DES
IN-1
F
A
B-FRAGMENTS
DURCH
CDR
TRANSPLANTATION
AUF
DER
GRUNDLAGE
DES
MENSCHLICHEN
ANTI-THYROIDPEROXIDASE
AUTOANTIKOERPERS
TRI
.9
.
127
3.5.1
AUSWAHL
DER
ZU
HUMANISIERENDEN
POSITIONEN
UND
SYNTHESE
DER
GENE
FUER
DIE
V
L
-
UND
DIE
VU-DOMAENE
DURCH
ASSEM
WY-PCR
.
128
3.5.2
HERSTELLUNG
UND
FUNKTIONELLE
ANALYSE
DES
HUMLL.1.8
F
A
B-FRAGMENTS
.
133
3.6
FUSIONSPROTEINE
AUS
F
A
B-FRAGMENTEN
UND
DER
TEM1
SS-LACTAMASE
.
136
3.6.1
KONSTRUKTION
VON
EXPRESSIONSVEKTOREN
UND
GENTECHNISCHE
HERSTELLUNG
VON
FUSIONSPROTEINEN
EINES
F
A
B-FRAGMENTS
MIT
DER
TEM1
SS-LACTAMASE
.
136
3.6.2
FUNKTIONELLE
ANALYSE
VON
FUSIONSPROTEINEN
AUS
SS-LACTAMASE
UND
FAB
FRAGMENT
UND
IHRE
PRAKTISCHE
ANWENDUNG
IM
ELISA
.
143
4
DISKUSSION
.146
4.1
DIE
SEKRETION
VON
EUKARYONTISCHEN
PROTEINEN
IN
E.
COLI
.
146
4.1.1
FUNKTIONELLE
PRODUKTION
VON
ANTIKOERPERFRAGMENTEN
IM
FERMENTER
.
148
4.1.2
HERSTELLUNG
UND
REINIGUNG
LOESLICHER
FRAGMENTE
VON
NOGO-A
IN
E.
COLI
.
150
4.2
AFFINITAETSOPTIMIERUNG
DES
IN-1
F
A
B-FRAGMENTS
MITTELS
PROTEIN-ENGINEERING
.
152
4.2.1
ERZEUGUNG
VON
MUTANTEN
DER
V
L
-DOMAENE
DES
IN-1
F
A
B-FRAGMENTS
.
155
4.2.2
DIE
SELEKTION
OPTIMIERTER
F
A
B-FRAGMENTE
MIT
EINEM
KOLONIE-FILTER
STAPELTEST
.
157
4.2.3
QUANTITATIVE
NACHWEISVERFAHREN
FUER
DIE
MOLEKULARE
BINDUNG
ZWISCHEN
MUTIERTEN
IN-1
FAB-FRAGMENTEN
UND
NIFR2
BZW.
NIFR4
.
160
4.3
NEUTRALISIERUNG
VON
NOGO-A
DURCH
VARIANTEN
DES
IN-1
F
A
B-FRAGMENTS
.
161
INHALTSVERZEICHNIS
_
Y
4.4
AUSBLICK
.
166
5
ZUSAMMENFASSUNG
.
167
6
LITERATUR
.169
7
ABKUERZUNGEN
.186
8
ANHANG
.
188
8.1
BERECHNETE
MOLARE
MASSE
UND
VORHERGESAGTER
MOLARER
EXTINKTIONSKOEFFIZIENT
DER
IN
DIESER
ARBEIT
VERWENDETEN
REKOMBINANTEN
PROTEINE
.
188
8.2
AMINOSAEURE-UND
DNA-SEQUENZ
DER
VARIABLEN
DOMAENEN
DES
ANTIKOERPERS
IN
1
.
189
8.3
AMINOSAEURE
UND
DNA-SEQUENZ
DES
REKOMBINANTEN
NOGO-A
FRAGMENTS
NIFR2
.
190
8.4
DURCH
AFFINITAETSMATURIERUNG
ERHALTENE
VARIANTEN
DER
VT-DOMAENE
VON
IN-1
.
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