Genomische Unterschiede zwischen Shiga-Toxin-produzierenden Escherichia-coli- (STEC) O157:H7 und Sorbitol-fermentierenden (SF) STEC O157:H- -Stämmen:
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INHALTSVERZEICHNIS
A ZUSAMMENFASSUNG.1
SUMMARY.3
B EINLEITUNG.5
1. BEDEUTUNG UND ERREGERSPEKTRUM VON DURCHFALLERKRANKUNGEN.5
2. DER PATHOTYP SHIGA TOXIN-PRODUZIERENDE
E. COLI (STEC).5
3. SHIGA TOXINE.7
4. WEITERE PATHOGENITAETSFAKTOREN DER STEC.8
4.1. DIE PATHOGENITAETSINSEL LEE.8
4.2. ANDERE ADHAERENZFAKTOREN.10
4.3. EISENAUFNAHMESYSTEME.11
4.4. EHEC-HAEMOLYSIN.12
4.5. ENTEROAGGREGATIVES HITZESTABILES TOXIN.12
4.6. TYP II-SEKRETIONSSYSTEM.12
4.7. SERINPROTEASE.13
4.8. KATALASE/PEROXIDASE.13
5. BEDEUTUNG VON 0157 INNERHALB DER STEC-SEROGRUPPEN.14
6. VIRULENZGENETISCHE UNTERSCHIEDE ZWISCHEN STEC 0157:H7 UND SF STEC
0157:H'. 15
7. PHYLOGENIE DES 0157-KOMPLEXES.16
8. AUFGABENSTELLUNG.18
C EXPERIMENTALTEIL.19
1. GERAETE, CHEMIKALIEN UND SONSTIGE MATERIALIEN.19
1.1. GERAETE.19
1.2. REAGENZIEN.20
1.3. SONSTIGE MATERIALIEN.20
2. BAKTERIENSTAEMME, NUKLEINSAEUREN UND BIOREAGENZIEN.21
2.1. BAKTERIENSTAEMME.21
2.2. PLASMIDE.22
2.3. OLIGONUKLEOTIDE.22
2.4. BIOREAGENZIEN.22
3. MEDIEN, PUFFER UND ALLGEMEINE LOESUNGEN.23
3.1. MEDIEN.23
3.2. PUFFER UND ALLGEMEINE LOESUNGEN.23
4. BAKTERIENSTAMMHALTUNG. 24
5. ERSTELLUNG EINER COSMID-GENBANK MIT SF STEC 0157:H' -STAMM 493/89.24
5.1. PRAEPARATION DER DNA DES STAMMES 493/89.24
5.2. PRAEPARATION DER COSMIDVEKTOR-DNA.25
5.3. LIGATION UND VERPACKUNG IN PHAGENKOEPFE.25
5.4. PRAEPARATION DER WIRTSZELLEN.26
5.5. TRANSDUKTION.26
5.6. PRAEPARATION DER GENBANK.26
6. ISOLIERUNG DER COSMID-DNA MIT QIAGEN PLASMID MIDI KIT.27
7. HORIZONTALE AGAROSEGEL-ELEKTROPHORESE.28
8. DNA-SEQUENZIERUNG.29
BIBLIOGRAFISCHE INFORMATIONEN
HTTP://D-NB.INFO/968386032
II
INHALTSVERZEICHNIS
9. SUBKLONIERUNG VON COSMID-INSERTFRAGMENTEN.31
9.1. RESTRIKTION GENOMISCHER UND VEKTORIELLER DNA.31
9.2. DEPHOSPHORYLIERUNG.31
9.3. AUFREINIGUNG VON DNA AUS ELEKTROPHORESEGEL MIT PREP-A-GENE.31
9.4. LIGATION.32
10. HERSTELLUNG KOMPETENTER DH5A-ZELLEN UND TRANSFORMATION.32
10.1. ERSTELLUNG KOMPETENTER DH5A-ZELLEN.32
10.2. TRANSFORMATION.33
11. SCHNELLMETHODE PLASMID-DNA-ISOLIERUNG.34
12. PLASMID-DNA-ISOLIERUNG MITTELS QIAGEN MINI PURIFICATION KIT.34
13. POLYMERASE-KETTENREAKTION (PCR).35
14. PCR-AMPLIFIKAT-AUFREINIGUNG MIT QIAGEN-PCR-PURIFICATION-KIT.37
15. SOUTHERN BLOT-HYBRIDISIERUNG MIT ECL.37
15.1. DNA-TRANSFER VON AGAROSEGELEN AUF NITROZELLULOSE.37
15.2. HYBRIDISIERUNG MARKIERTER DNA MIT IMMOBILISIERTER ZIEL-DNA.38
15.3. DETEKTION DER HYBRIDISIERTEN DNA.39
16. SOUTHERN BLOT MIT DIGOXIGENIN NACH BOEHRINGER.39
16.1. MARKIERUNG DER SONDEN-DNA. 40
16.2. HYBRIDISIERUNG MARKIERTER DNA MIT IMMOBILISIERTER ZIEL-DNA.40
16.3. FAERBUNG DER YYSONDEN-DNA-ZIEL-DNA-HYBRIDE".4]
17. CHROMOSOMALE DNA MIT PHENOLMETHODE.41
18. ISOLIERUNG CHROMOSOMALER DNA MIT NUCLEOBOND-SAEULEN.42
19. ERSTELLUNG EINER SUBTRAKTIVEN GENBANK MIT HILFE DES CLONTECH
PCR-SELECT
GENOME SUBTRACTION KIT.43
19.1. ALLGEMEINES ZUR METHODIK.43
19.2. ISOLIERUNG GENOMISCHER DNA.45
19.3. RESTRIKTION DER TESTER- UND DRIVER-DNA.45
19.4. LIGATION DER TESTER-DNA MIT ADAPTOREN.46
19.5. ERSTE HYBRIDISIERUNG.48
19.6. ZWEITE HYBRIDISIERUNG.48
19.7. PCR-AMPLIFIZIERUNG.49
19.8. UNTERSCHIEDLICHE EXPERIMENTELLE BEDINGUNGEN.50
19.8.1. AENDERUNG DES TEMPERATURPROGRAMMS AM THERMOCYCLER.50
19.8.2. ERHOEHUNG DER ZYKLENANZAHL IN DER ERSTEN PCR.51
19.8.3. VERWENDUNG EINES ANDEREN TAQ-POLYMERASE-SYSTEMS.51
19.8.4. ERHOEHUNG DER MGC^-KONZENTRATION IM PCR-MASTERMIX.51
19.8.5. ERHOEHUNG DER EINGESETZTEN DNA-KONZENTRATION DER RESTRINGIERTEN
DRIVER
UND TESTER-DNA.51
20. BESTAETIGUNG TESTER-SPEZIFISCHER SEQUENZEN.52
20.1. LIGIERUNG DER SUBTRAKTIVEN PCR-PRODUKTE IN DEN BLUESCRIPTVEKTOR
UND
TRANSFORMATION IN KOMPETENTE DH5A-ZELLEN.52
20.2. LIGIERUNG DER SUBTRAKTIVEN PCR-PRODUKTE IN PCR 2.1 UND
TRANSFORMATION IN
KOMPETENTE INVAF'-ZELLEN.53
20.3. SPEZIFITAETSKONTROLLE MITTELS MAKROARRAY.54
21. GENOMVERGLEICH MITTELS E. COLI K-12 MAKROARRAY.55
22. GENOMVERGLEICH MITTELS PATHOARRAY.57
23. KOLONIE-BLOTHYBRIDISIERUNG.58
24. SEQUENZ-IDENTIFIKATIONSNUMMERN.58
\
INHALTSVERZEICHNIS
III
D ERGEBNISSE.59
1. SEQUENZIERUNG DER COSMID-GENBANK EINES SF STEC 0157:H' -STAMMES.59
1.1. SUBKLONIERUNG INTERESSANTER COSMIDINSERT-FRAGMENTE.60
1.2. CHARAKTERISIERUNG EINES 8,8 KB SPEZIFISCHEN SF STEC 0157:H'
-FRAGMENTES.62
1.3. SOUTHERN BLOT ZUR UEBERPRUEFUNG DES VORKOMMENS VON/EC-KOMPONENTEN.64
1.4. VORKOMMEN DER SRL-PAI-HOMOLOGEN SEQUENZ IN ANDEREN SF STEC 0157:H'
-
UND STEC 0157:H7-STAEMMEN.65
2. SUPPRESSIVE SUBTRAKTIVE HYBRIDISIERUNG (SSH).66
2.1. EINFLUSS VON VERAENDERUNGEN DER REAKTIONSBEDINGUNGEN AUF DAS ERGEBNIS
DER SSH 66
2.2. DURCH SSH VON E. COLI 493/89 VS. E. COLI EDL933 ERMITTELTE
SPEZIFISCHE
FRAGMENTE.67
2.3. DETEKTIERUNG DES GESAMTEN OFFENEN LESERAHMENS FUER
EFAL/LIFA.69
2.4. VERGLEICH DER EFAL/LIFA SEQUENZ VON E. COLI 493/89 MIT DER VON E.
COLI EDL933 . 70
2.5. VORKOMMEN VON EFAL/LIFA IN ANDEREN SF STEC 0157:H' UND STEC
0157:H7-
STAEMMEN.71
3. GENOMVERGLEICH MITTELS
E. COLI K-12-MAKROARRAY-METHODE.73
3.1. ANZAHL NICHT HYBRIDISIERTER SPOTS FUER E. COLI 493/89 UND E. COLI
EDL933 .74
3.2. AUFSCHLUESSELUNG NACH FUNKTIONSKLASSEN.75
3.3. VERGLEICH DES HYBRIDISIERUNGSMUSTERS.77
4. VERGLEICH DER AUSSTATTUNG AN VIRULENZ-ASSOZIIERTEN GENEN MITTELS
MAKROARRAY-METHODE.78
4.1. VERGLEICH DER HYBRIDISIERUNG VON
E. COLI 493/89 MIT DER VON E. COLI EDL933.79
4.2. IDENTIFIZIERUNG DES CYTOLETHAL DISTENDING TOXINS IN E. COLI
493/89.81
4.3. UEBERPRUEFUNG AUF C #-ENTHALTENDE COSMIDE DER E. COLI
493/89-GENBANK.82
4.4. VERGLEICH DER CT/T-SEQUENZ VON E. COLI 493/89 MIT CDT-I, CDT-IL UND
CDT-III.83
4.5. IDENTIFIZIERUNG VON PHAGENSEQUENZEN ALS FLANKIERENDE CCFR-REGIONEN
IN
E. COLI
493/89. 84
4.6. SHOTGUN-GENBANK DES CUEF/-COSMID-INSERTFRAGMENTS VON
E. COLI 493/89.84
4.7. HAEUFIGKEIT VON CDT IN ANDEREN SF STEC 0157:H' -STAEMMEN.85
E DISKUSSION.87
1. GEMEINSAME CHROMOSOMALE ELEMENTE DER 0157-SEROTYPEN H7 UND SF H'.87
2. VERGLEICH DER 0157-SEROTYPEN MIT
E. COLI K-12-STAMM MG1655 .89
3. VERGLEICH MIT SHIGELLA FLEXNERI 2A.90
4. IDENTIFIZIERUNG DES KOMPLETTEN EFAL/LIFA-OKFS IN E. COLI 493/89.91
5. VORKOMMEN VON CDT IN STEC 0157.92
6. EVOLUTIONAERE ASPEKTE DES 0157-KOMPLEXES.94
7. ABSCHLUSSBETRACHTUNG.95
F LITERATURVERZEICHNIS.96
G ANHANG.HO
ERKLAERUNG.121
LEBENSLAUF.122 |
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