Entwicklung einer "seminested" PCR und einer "Real-Time-PCR" zum Nachweis von Mycobacterium avium ssp. paratuberculosis bei Rindern:
Gespeichert in:
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Format: | Abschlussarbeit Buch |
Sprache: | German |
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2003
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I
INHALTSVERZEICHNIS
1.
EINLEITUNG
1
2.
SCHRIFTTUM
2
2.1
TAXONOMIE
UND
CHARAKTERISIERUNG
DES
ERREGERS
2
2.2
VORKOMMEN
UND
UEBERTRAGUNG
4
2.3
PATHOGENESE
UND
IMMUNANTWORT
5
2.4
DIAGNOSEVERFAHREN
9
2.4.1
INDIREKTER
ERREGEMACHWEIS
9
2.4.2
DIREKTER
ERREGEMACHWEIS
14
2.4.3
REAL
TIME
PCR
22
3.
EIGENE
UNTERSUCHUNGEN
26
3.1
ARBEITSKONZEPT
26
3.2
VERZEICHNIS
DER
VERWENDETEN
ABKUERZUNGEN
27
3.3
MATERIAL
UND
METHODEN
28
3.3.1
VERWENDETE
BAKTERIENSTAEMME
UND
FELDISOLATE
28
3.3.2
ZIEHL-NEELSEN-FAERBUNG
30
3.3.3
BAKTERIENANZUCHT
UND
AUFREINIGUNG
30
3.3.3.1
MEDIEN
30
3.3.3.2
ANZUCHT
VON
MYCOBACTERIEN
31
33.3.3
AUFBEREITUNG
VON
DNA
AUS
MYCOBACTERIEN-KULTUREN,
32
AUS
KOTPROBEN
UND
AUS
ORGANGEWEBE
FUER
DIE
PCR
3.3.4
POLYMERASE-KETTEN-REAKTION
(PCR)
33
3.3.4.1
AUSWAHL
DER
PRIMER
FUER
DIE
PCR
33
3.3.4.2
PRIMER
ZUR
AMPLIFIKATION
EINES
197
BP
FRAGMENTS
ALS
34
BASIS
FUER
DIE
ERSTELLUNG
EINER
DNA
SONDE
3.3.4.3
"SEMINESTED"
POLYMERASE-KETTEN-REAKTION
34
3.3.4.4
AGAROSEGELELEKTROPHORESE
35
3.3.5
POLYMERASE-KETTEN-REAKTION
MIT
DEM
LIGHT
CYCLERYY
35
N
3.3.5.1
AUSWAHL
DER
PRIMER
UND
DER
HYBRIDISIERUNGSSONDEN
36
FUER
DIE
LIGHT
CYCLER
PCRYY
3.3.5.2
LIGHT
CYCLERYY
PCR
MIT
SYBR
GREEN
I
36
3.3.5.3
LIGHT
CYCLERYY
PCR
MIT
HYBRIDISIERUNGSSONDEN
37
3.3.6
SEQUENZIERUNG
DER
PCR-PRODUKTE
37
3.3.6.1
REINIGUNG
DER
PCR-PRODUKTE
FUER
DIE
SEQUENZIERUNG
37
3.3.6.2
KLONIERUNG
DER
PCR-AMPLIFIKATE
FUER
DIE
SEQUENZIERUNG
38
3.3.6.3
ISOLIERUNG
VON
PLASMID-DNA
38
3.3.6.4
SEQUENZIERUNG
DER
PCR-AMPLIFIKATE
39
3.3.7
REINIGUNG
VON
PLASMID-DNA
FUER
DIE
HYBRIDISIERUNGSSONDE
40
3.3.8
"RANDOM
PRIMED"
DNA-MARKIERUNG
MIT
DIGOXIGENIN-DUTP
'
40
3.3.9
DETEKTION
DES
587
BP
UND
DES
278
BP
FRAGMENTS
MITTELS
SOUTHERN
BLOT
41
3.3.9.1
TRANSFER
DER
DNA
AUS
DEM
AGAROSEGEL
AUF
EINE
MEMBRAN
41
3.3.9.2
HYBRIDISIEREN
DER
DIGOXIGENIN-MARKIERTEN
DNA
SONDE
41
3.3.9.3
IMMUNOLOGISCHE
DETEKTION
42
3.3.10
ELISA
ZUM
NACHWEIS
VON
ANTIKOERPERN
GEGENUEBER
M.
PTB.
IN
MILCH
43
UND
SERUMPROBEN
3.3.11
STATISTISCHE
BERECHNUNGEN
46
4.
ERGEBNISSE
47
4.1
ENTWICKLUNG
DER
"SEMINESTED"
PCR
47
4.1.1
AUSWAHL
DER
PRIMER
47
4.1.2
BEDINGUNGEN
DER
"SEMINESTED"
PCR
47
4.1.3
SPEZIFITAET
DER
"SEMINESTED"
PCR
50
4.1.3.1
SPEZIFITAETSNACHWEIS
DER
YYSEMINESTED
"
PCR
MITTELS
50
REFERENZSTAEMMEN
4.1.3.2
SPEZIFITAETSNACHWEIS
DER
YYSEMINESTED
"
PCR
MITTELS
KLONIERUNG
51
UND
SEQUENZIERUNG
DES
587
BP
UND
278
BP
FRAGMENTS
4.1.3.3
SPEZIFITAETSNACHWEIS
DER
YYSEMINESTED
"
PCR
MITTELS
SOUTHERN
51
BLOT
ANALYSE
4.1.4
SENSITIVITAETSNACHWEIS
UND
OPTIMIERUNG
DER
"SEMINESTED"
PCR
52
4.1.4.1
SENSITIVITAET
DER
"SEMINESTED"
PCR
52
4.1.4.2
OPTIMIERUNG
DER
"SEMINESTED"
PCR
54
4.1.4.3
ANWENDUNG
DER
OPTIMIERTEN
"SEMINESTED"
PCR
BEI
KOTPROBEN
58
VON
RINDERN
4.2
ETABLIERUNG
DER
M.
PTB.
PCR
AUF
DEM
LIGHT
CYCLER
YY
(ROCHE,
MANNHEIM)
59
M
4.2.1
DETEKTION
DES
587
BP
FRAGMENTS
MIT
SYBR
GREEN
59
4.2.2
DETEKTION
DES
278
BP
FRAGMENTS
MIT
SYBR
GREEN
61
4.2.3
DETEKTION
DES
278
BP
FRAGMENTS
MIT
HYBRIDISIERUNGSSONDEN
67
4.2.4
UEBERPRUEFUNG
DER
AMPLIFIZIERUNG
DES
278
BP
FRAGMENTS
ANHAND
VON
68
REFERENZSTAEMMEN
4.2.5
DETEKTION
DES
278
BP
FRAGMENTS
ANHAND
AUS
KOTPROBEN
DES
74
RINDERBESTANDES
"L"
AUFGEREINIGTER
DNA
4.2.6
VERGLEICH
DER
SENSITIVITAET
VON
"SEMINESTED"
PCR
UND
DETEKTION
DES
74
278
BP
FRAGMENTS
MIT
HYBRIDISIERUNGSSONDEN
4.2.7
EINSATZ
VON
DNA
AUS
"POOLPROBEN"
AUS
RINDERKOT
IN
DER
PCR
75
4.3
UNTERSUCHUNG
VON
EINZELTIERPROBEN
UND
BESTANDSUNTERSUCHUNGEN
MITTELS
78
M.
PTB.
ELISA
UND
"SEMINESTED"
PCR
4.3.1
GEWINNUNG
VON
UNTERSUCHUNGSMATERIAL
78
4.3.2
BESTANDSUNTERSUCHUNGEN
78
4.3.3
ERGEBNISSE
DER
"SEMINESTED"
PCR
AUS
KOT
UND
GEWEBEPROBEN,
IN
79
BEZUG
ZU
DEN
ERGEBNISSEN
DER
ANZUCHT
UND
DER
ZIEHL-NEELSEN-FAERBUNG
4.3.3.1
ANZUCHTVONM.
PTB.
AUFHEY-MEDIUMAUSKOTUND
79
LYMPHKNOTENGEWEBE
4.3.3.2
"SEMINESTED"
PCR
AUS
KOT
UND
GEWEBEPROBEN
79
4.3.3.3
SENSITIVITAET
UND
SPEZIFITAET
VON
ZIEHL-NEELSEN-FAERBUNG
UND
80
"SEMINESTED
"
PCR
4.3.3.4
UNTERSUCHUNGEN
VON
SEREN
MITTELS
M.
PTB.
ELISA
UND
80
ERGEBNISSE
DER
"SEMINESTED"
PCR
AUS
DEN
ZUGEHOERIGEN
KOTPROBEN
5.
DISKUSSION
82
6.
ZUSAMMENFASSUNG
93
7.
SUMMARY
94
8.
LITERATURVERZEICHNIS
95 |
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