Regulation von programmiertem Zelltod in den NSM-Schwesterzellen im Nervensystem von Caenorhabditis elegans:
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2002
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INHALTSVERZEICHNIS
1 ZUSAMMENFASSUNG 5
2 EINLEITUNG 6
2.1 PROGRAMMIERTER ZELLTOD 6
2.2
CAENORHABDITIS ELEGANS ALS MODELLORGANISMUS 6
2.3 PROGRAMMIERTER ZELLTOD IN
C ELEGANS 10
2.3.1 DIE ZENTRALE ZELLTODMASCHINERIE 10
2.3.2 DIE ZENTRALE ZELLTODMASCHINERIE IST KONSERVIERT 12
2.3.3 ZELLTYPSPEZIFISCHE REGULATION DER ZELLTODMASCHINERIE 13
2.4 ZIELSETZUNG DER ARBEIT 15
3 MATERIAL UND METHODEN 17
3.1 MATERIALIEN 17
3.1.1 CHEMIKALIEN 17
3.1.2 GERAETE 18
3.1.3 VERBRAUCHSMATERIAL 18
3.1.4 ENZYME, ANTIKOERPER UND STANDARD 19
3.1.5 KITS 20
3.1.6 OLIGONUKLEOTIDE 20
3.1.7 VEKTOREN UND PLASMIDE 21
3.1.8 BAKTERIENSTAEMME 23
3.1.9 HEFESTAEMME 23
3.1.10 C. ELEGANS STAEMME 23
3.1.11 MEDIEN 27
3.2 MOLEKULARBIOLOGISCHE METHODEN 28
3.2.1 ISOLIERUNG VON PLASMID-DNA 28
3.2.1.1 STET-LYSE 28
3.2.1.2 QIAGEN MIDI-PREP 28
3.2.2 REINIGUNG UND FAELLUNG VON DNA 28
3.2.2.1 ETHANOLFAELLUNG 28
3.2.2.2 PHENOL/CHLOROFORMFAELLUNG / 28
3.2.3 AGAROSE-GELELEKTROPHORESE 29
3.2.4 DNA-ISOLIERUNG AUS AGAROSEGELEN 29
3.2.5 KONZENTRATION UND REINHEITSBESTIMMUNG VON DNA 29
3.2.6 ENZYMATISCHE REAKTIONEN MIT DNA 30
3.2.6.1 RESTRIKTIONSSPALTUNG VON DNA 30
3.2.6.2 AUFFULLEN VON 5'-UEBERHAENGENDEN DNA-ENDEN 30
3.2.6.3 DEPHOSPHORYLIERUNG VON DNA-ENDEN 30
3.2.6.4 LIGATION 30
3.2.6.5 POLYMERASE-KETTENREAKTION (PCR) 30
3.2.6.6 PCR-MUTAGENESE 31
3.2.7 HERSTELLUNG KOMPETENTER ZELLEN 31
3.2.8 TRANSFORMATION IN BAKTERIEN 32
1
BIBLIOGRAFISCHE INFORMATIONEN
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INHALTSVERZEICHNIS
3.2.9 KULTIVIERUNG UND KONSERVIERUNG VON .CO//-STAEMMEN 32
3.3 PROTEINBIOCHEMISCHE METHODEN 32
3.3.1
IN VITRO TRANSKRIPTION UND TRANSLATION VON CES-1 32
3.3.2 BAKTERIELLE EXPRESSION VON GST-CES-1 FUSIONSPROTEINEN 32
3.3.3 DIALYSE UND AUFBEWAHRUNG VON PROTEINEN 33
3.3.4 PROTEINBESTIMMUNG NACH BRADFORD 34
3.3.5 POLYACRYLAMID-GELELEKTOPHORESE NACH LAEMMLI 34
3.3.6 PROTEINFAEIBUNG MIT COOMASSIE BRILLIANT BLAU 34
3.3.7 GELRETARDIERUNGSANALYSE (EMSA) 35
3.3.7.1 PCR MIT RADIOAKTIV MARKIERTEN DATPS 35
3.3.7.2 REINIGUNG UND ISOLIERUNG VON RADIOAKTIV MARKIERTEN PCR-PRODUKTEN
35
3.3.7.3 PROTEIN-DNA-BINDUNG 36
3.4 IMMUNOLOGISCHE METHODEN 36
3.4.1 WESTERN BLOT-ANALYSE 36
3.4.2 YYSTRIPPEN" VON WESTERN BLOTS 37
3.4.3 IMMUNOFLUORESZENZ 37
3.4.3.1 FIXIERUNG UND ANTIKOERPERFIIRBUNG VON
C. ELEGANS EMBRYONEN NACH
METZSTEIN 37
3.4.3.2 FIXIERUNG UND ANTIKOERPERFAERBUNG VON C.
ELEGANS EMBRYONEN NACH
BOSSINGER 39
3.5 METHODEN DES HEFE-EXPRESSIONSSYSTEMS 40
3.5.1 ANZUCHT VON
S. CEREVISIAE 40
3.5.2 LITHIUMACETAT-TRANSFORMATION VON
S, CEREVISIAE 40
3.5.3 YYYEAST ONE-HYBRID"-SYSTEM 40
3.6 BIOLOGISCHE UNTERSUCHUNG VON
C. ELEGANS 41
3.6.1 KULTIVIERUNG UND ANZUCHT VON
C. ELEGANS 41
3.6.2 REINIGUNG KONTAMINIERTER TIERE 41
3.6.3 EINFRIEREN / AUFTAUEN 41
3.6.4 INDUKTIOH VON MAENNCHEN DURCH HITZESCHOCK 42
3.6.5 GENETISCHE METHODEN 42
3.6.5.1 KREUZUNGEN 42
3.6.5.2 TRANSFORMATION VON C. ELEGANS DURCH MIKROINJEKTION VON DNA 43
3.6.53 INTEGRATION EXTRACHROMOSOMALER ELEMENTE DURCH EMS-MUTAGENESE 43
3.6.5.4 TRANSFORMATION VON C. ELEGANS DURCH YYMICROPARTICLE
BOMBARDMENT"44
3.6.6 MIKROSKOPIE LEBENDER TIERE
YY
' 45
3.6.7 ISOLIERUNG VON DNA AUS C. ELEGANS 45
3.6.8 HERSTELLUNG VON EMBRYO-LYSAT FIIR WESTERN-BLOT-ANALYSEN 46
4 ERGEBNISSE 47
4.1 DER
PTPH-L::GFP-REPORTER WIRD IN DEN NSM-ZELLEN UND DEN YYUNTOTEN"
NSM-SCHWERSTERZELLEN EXPRIMIERT 47
4.1.1 INJEKTION DES
PTPH-1: REPORTERS IN C. ELEGANS 47
4.1.2 INTEGRATION DES PTPH-1:.^-REPORTERS DURCH EMS-MUTAGENESE 48
4.1.3 KOPPLUNGSANALYSEN 48
4.1.4 EXPRESSION DES
PTPH-1: .^-REPORTERS IN AUSGEWAEHLTEN MUTANTEN 52
2
INHALTSVERZEICHNIS
4.2 CES-1-EXPRESSION IN C
ELEGANS EMBRYONEN 53
4.2.1 CES-1-EXPRESSIONSMUSTER IN FIXIERTEN EMBRYONEN 53
4.2.2 KOLOKALISIERUNG VON CES-1 UND P
CEH-2::GFP IN C. ELEGANS EMBRYONEN 54
4.3 REGION B IM
EGL-1-LOKUS IST FUER DEN PROGRAMMIERTEN ZELLTOD DER NSM-
SCHWESTERZELLEN ERFORDERLICH 56
4.3.1 INJEKTION DEFINIERTER FRAGMENTE DES EG/-/-LOKUS IN
EG/-/(LF)-TIEREN 56
4.3.2 UNTERSUCHUNG DER NSM-ZELLEN UND DER NSM-SCHWESTERZELLEN IN
TRANSGENEN EG/-/(LF)-TIEREN 58
4.3.3 REGION B ENTHAELT VIER KONSENSUS-SEQUENZEN FIIR SNAIL-BINDEPROTEINE
60
4.4 CES-1 BINDET
IN VITRO SPEZIFISCH AN REGION B IM EGL-/-LOKUS 61
4.4.1 AMPLI FIZIERUNG DER DNA-PROBEN 61
4.4.2 EIN GST-CES-1 FUSIONSPROTEIN BINDET
IN VITRO AN DIE SNAIL-BINDESTELLEN
62
4.4.3 CES-1-BINDUNG AN SNAIL-BINDESTELLEN IM YYYEAST ONE-HYBRID"-SYSTEM
65
4.4.4 CES-1 BINDUNG AN DEN EGL-/-PROMOTOR IN EXTRACHROMOSOMALEN
ELEMENTEN 67
4.5 FUNKTIONALE SNAIL-BINDESTELLEN IN REGION B SIND FUER DIE
ZELLTODSPEZIFIZIERUNG DER NSM-SCHWSTERZELLEN NOTWENDIG 71
4.5.1 MODELL FUER DIE ZELLTODSPEZIFIZIERUNG DER NSM-SCHWESTERZELLEN 71
4.5.2 TRENNUNG DER CES-L-BINDUNG UND DER BHLH-BINDUNG AN DIE VIER
SNAIL/E-BOX-BINDESTELLEN IN REGION B 73
4.5.3 FUNKTIONALE UNTERSUCHUNG DER SNAIL-BINDESTELLEN IN REGION B
IN VIVO 75
4.5.4 TRANSFORMATION VON C. ELEGANS DURCH YYMICROPARTICLE BOMBARDMENT"
77
4.6 PROGRAMMIERTER ZELLTOD DER NSM-SCHWSTERZELLEN WIRD DURCH CES-1 UND
HLH-2/HLH-3 UEBER GEMEINSAME BINDESTELLEN IM #/-/-LOKUS REGULIERT 79
5 DISKUSSION 82
5.1 DIE ^/-/-EXPRESSION WIRD IN DEN NSM-SCHWESTERZELLEN TRANSKRIPTIONAL
REGULIERT 82
5.2 DER PF/?A-/::G/P-REPORTER WIRD IN DEN NSM-ZELLEN UND DEN YYUNTOTEN"
NSM-SCHWESTERZELLEN EXPRIMIERT 83
5.3 DIE ^/-/-EXPRESSION WIRD IN DEN NSM-SCHWESTERZELLEN VOM CES-1-
REPRESSOR TRANSKRIPTIONAL REGULIERT 84
5.4 HLH-2/HLH-3 IST EIN POTENTIELLER AKTIVATOR DER
EGL-I-TRANSKRIPTION IN
DEN NSM-SCHWESTERZELLEN 86
5.5 WAEHREND DER REGULATION DES PROGRAMMIERTEN ZELLTODS DER NSM-
SCHWESTERZELLEN KONKURRIEREN CES-1 UND HLH-2/HLH-3 FUER DIE GLEICHEN
BINDESTELLEN IM EG/-/-LOKUS 87
5.6 DIE ZELLTYPSPEZIFISCHEN REGULATOREN DES PROGRAMMIERTEN ZELLTODS IN
DEN
NSM-SCHWESTERZELLEN SIND ZWISCHEN C. ELEGANS UND HOEHEREN ORGANISMEN
KONSERVIERT 89
3
INHALTSVERZEICHNIS
6 LITERATURVERZEICHNIS
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