Entwicklung von immunanalytischen, chromatographischen und massenspektrometrischen Methoden zur Bestimmung cyanobakterieller Hepatotoxine (Microcystine und Nodularine):
Gespeichert in:
| 1. Verfasser: | |
|---|---|
| Format: | Buch |
| Sprache: | German |
| Veröffentlicht: |
München
Hieronymus
2002
|
| Ausgabe: | Als Typoskr. gedr. |
| Schlagworte: | |
| Online-Zugang: | Inhaltsverzeichnis |
| Beschreibung: | Zugl.: München, Techn. Univ., Diss., 2001 |
| Beschreibung: | VII, 255 S. Ill., graph. Darst. : 21 cm |
| ISBN: | 3897912708 |
Internformat
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I
NHALTSVERZEICHNIS
I
I
NHALT
I.
E
INLEITUNG
UND
P
ROBLEMSTELLUNG
.
1
II.
T
HEORETISCHE
G
RUNDLAGEN
.
3
1
C
YANOBAKTERIEN
UND
DEREN
T
OXINE
.
3
1.1
CYANOBAKTERIEN
.
3
1.1.1
KLASSIFIZIERUNG,
EIGENSCHAFTEN
UND
VORKOMMEN
.
3
1.1.2
FAKTOREN,
DIE
WACHSTUM,
DOMINANZ
UND
TOXIZITAET
VON
CYANOBAKTERIEN
BEEINFLUSSEN
.
5
1.1.3
VERGIFTUNGEN
AUFGRUND
VON
CYANOBAKTERIEN
.
6
1.1.4
CYANOBAKTERIEN
IN
DEUTSCHLAND
.
7
1.1.5
RICHTLINIEN
UND
GRENZWERTE
FUER
CYANOBAKTERIEN
.
8
1.2
CYANOBAKTERIELLE
TOXINE
.
9
1.2.1
EINTEILUNG
DER
CYANOBAKTERIELLEN
TOXINE
.
9
1.2.2
STRUKTUR,
EIGENSCHAFTEN
UND
SYNTHESE
DER
CYCLISCHEN
HEPATOTOXINE
.
11
1.2.3
TOXIKOLOGIE
.
14
1.2.4
STABILITAET
UND
ABBAU
DER
MICROCYSTINE
.
17
1.2.5
GRENZWERTE
UND
TRINKWASSERMANAGEMENT
.
18
2
A
NALYTIK
VON
M
ICROCYSTINEN
.
20
2.1
PROBENAHME
UND
PROBENVORBEREITUNG
.
20
2.2
TRENNMETHODEN
.
22
2.2.
1
UMKEHRPHASEN-CHROMATOGRAPHIE
.
22
2.2.2
ANDERE
HPLC-METHODEN
.
24
2.2.3
GASCHROMATOGRAPHIE
(GC)
.
24
2.2.4
KAPILLARELEKTROPHORESE
(CE)
UND
MIZELLARE
ELEKTROKINETISCHE
CHROMATOGRAPHIE
(MECC)
.
24
2.2.5
DUENNSCHICHTCHROMATOGRAPHIE
(DC)
.
25
2.3
BIOANALYTISCHE
METHODEN
.
25
2.3.1
BIOLOGISCHE
TESTS
.
25
2.3.2
ENZYM-INHIBITIONSASSAYS
.
26
2.3.3
IMMUNOASSAYS
.
30
2.4
MASSENSPEKTROMETRISCHE
METHODEN
.
32
II
3
I
MMUNOLOGISCHE
M
ETHODEN
.
38
3.1
ANTIKOERPER
.
38
3.1.1
STRUKTUR
VON
ANTIKOERPERN
.
38
3.1.2
ANTIGEN-ANTIKOERPER-WECHSELWIRKUNG
.
39
3.1.3
BILDUNG
VON
ANTIKOERPERN
.
41
3.1.4
GEWINNUNG
VON
POLYKLONALEN
ANTIKOERPERN
.
42
3.1.5
SYNTHESE
VON
IMMUNKONJUGATES
.
42
3.1.6
IMMUNISIERUNGSPROTOKOLL
.
43
3.1.7
MONOKLONALE
ANTIKOERPER
.
44
3.1.8
ANDERE
ANTIKOERPERQUELLEN
UND
KUENSTLICHE
ANTIKOEIPER
.
46
3.2
IMMUNOASSAYS
.
48
3.2.1
HISTORISCHE
ENTWICKLUNG
UND
ANWENDUNGSGEBIETE
.
48
3.2.2
PRINZIP
UND
DURCHFUEHRUNG
.
49
3.2.3
MESSUNG
UND
AUSWERTUNG
VON
ELISAS
.
55
3.2.4
BESTIMMUNG
DER
AFIINITAETSKONSTANTEN
.
57
3.2.5
KREUZREAKTIVITAET
.
58
3.2.6
OPTIMIERUNG
KOMPETITIVER
IMMUNOASSAYS
.
59
4
M
ASSENSPEKTROMETRIE
IN
DER
P
EPTID
-
UND
P
ROTEINANALYTIK
.
61
4.1
EINFUEHRUNG.
.
61
4.2
LONISIERUNGSPRINZIP
(LONENQUELLEN)
.
62
4.2.1
PRINZIP
DER
ELEKTROSPRAY-IONISATION
(ESI)
.
62
4.2.2
PRINZIP
DER
MATRIX-UNTERSTUETZTEN
LASER-DESORPTION
(MALDI)
.
64
4.3
MASSENANALYSATOREN
.
65
4.3.1
PRINZIP
DES
FLUGZEIT-MASSENANALYSATORS
.
66
4.4
ASPEKTE
DER
BIOANALYTISCHEN
MASSENSPEKTROMETRIE
.
69
4.4.1
MASSENKALIBRIERUNG
.
69
4.4.2
QUANTIFIZIERUNG
UND
MATRIXEFFEKTE
.
70
4.4.3
SEQUENZIERUNG
VON
PEPTIDEN
MITTELS
MASSENSPEKTROMETRIE
.
72
5
I
MMUNOLOGISCHE
D
ETEKTION
IN
DER
C
HROMATOGRAPHIE
.
75
III.
E
RGEBNISSE
UND
D
ISKUSSION
.
78
1
HPLC
MIT
UV-D
ETEKTION
.
78
1.1
MICROCYSTINE
UND
IHRE
UV-ABSORPTION
.
78
1.2
OPTIMIERUNG
DES
LAUFTNITTELGRADIENTEN
.
81
1.3
AUSWAHL
DES
SAEULENMATERIALS
.
83
1.4
BESTIMMUNG
DER
NACHWEISGRENZE
.
88
1.5
MONITORING
DER
ENZYMATISCHEN
SPALTUNG
VON
MICROCYSTINEN
MITTELS
HPLC
.
88
I
NHALTSVERZEICHNIS
III
1.6
MONITORING
DER
CHEMISCHEN
HYDROLYSE
VON
MICROCYSTINEN
MITTELS
HPLC
.
89
1.7
MESSUNG
VON
REALPROBEN
MITTELS
HPLC-UV.
.
91
1.8
ZUSAMMENFASSUNG
UND
SCHLUSSFOLGERUNGEN
.
94
2
ELISA
MIT
MONOKLONALEN
M8H5-ANTIKOERPERN
ZUR
BESTIMMUNG
VON
M
ICROCYSTINEN
.
96
2.1
ANTIKOERPER
M8H5
.
96
2.2
HERSTELLUNG
DES
TRACERS
.
96
2.3
OPTIMIERTER
DIREKTER
ELISA
.
99
2.4
KREUZREAKTIONEN
.
101
2.5
EINFLUSS
VON
STOERUNGEN
(SALZGEHALT,
TENSIDE,
HUMINSTOJFE,
PH-WERT)
.
103
2.6
MESSUNG
VON
WASSERPROBEN.
105
2.7
ZUSAMMENFASSUNG
UND
SCHLUSSFOLGERUNGEN
.
107
3
H
ERSTELLUNG
VON
MONOKLONALEN
M
ICROCYSTIN
-LR-A
NTIKOERPERN
.
108
3.1
AUSWAHL
DER
HAPTENSTRUKTUR
UND
DES
TRAEGERPROTEINS.
108
3.2
SYNTHESE
UND
CHARAKTERISIERUNG
DES
IMMUNKONJUGATS
.
HO
3.3
VERLAUF
DER
IMMUNISIERUNGEN
.
117
3.3.1
IMMUNISIERUNG
MIT
MICROCYSTIN-LR-KLH-KONJUGAT
.
117
3.3.2
IMMUNISIERUNG
MIT
MICROCYSTIN-LR-COVA-KONJUGAT
.
118
3.4
FUSION
UND
SCREENING
ZUR
GEWINNUNG
EINES
MONOKLONALEN
ANTIKOERPERS
.
120
3.5
OPTIMIERTER
DIREKTER
KOMPETITIVER
ELISA
FUER
MICROCYSTIN-LR
.
121
3.6
BESTIMMUNG
DER
AFFLNITAETSKONSTANTE
.
122
3.7
KREUZREAKTIONEN
.
123
3.8
EINFLUSS
VON
STOERUNGEN
(SALZGEHALT,
TENSIDE,
HUMINSTOFFE,
PH-WERT)
.
124
3.9
MESSUNGEN
VON
WASSERPROBEN
.
126
3.10
ZUSAMMENFASSUNG
UND
SCHLUSSFOLGERUNGEN
.
127
4
H
ERSTELLUNG
EINES
MONOKLONALEN
A
DDA
-A
NTIKOERPERS
.
128
4.1
AUSWAHL
DES
HAPTENS
UND
DER
KOPPLUNGSSTELLE
.
128
4.2
SYNTHESE
DES
IMMUNOGENS
UND
DES
ENZYMTRACERS
.
129
4.3
VERLAUF
DER
IMMUNISIERUNGEN
.
133
4.4
FUSION
UND
SCREENING
ZUR
GEWINNUNG
EINES
MONOKLONALEN
ADDA-ANTIKOERPERS
.
135
4.5
OPTIMIERTER
DIREKTER
KOMPETITIVER
ELISA
.
137
4.6
KREUZREAKTIONEN
.
138
IV
4.7
MESSUNGEN
VON
WASSERPROBEN.
140
4.8
ZUSAMMENFASSUNG
UND
SCHLUSSFOLGERUNGEN
.
141
5
P
ROTEINPHOSPHATASE
-I
NHIBITIONSASSAY
.
142
6
M
EHRDIMENSIONALE
ELISA-D
ETEKTION
IN
DER
HPLC
.
144
6.1
MOTIVATION
.
144
6.2
EXPERIMENTELLE
DURCHFUEHRUNG
.
144
6.3
OPTIMIERUNG
DER
MEHRDIMENSIONALEN
HPLC-ELISA-KOPPLUNG
.
145
6.4
QUANTIFIZIERUNG
VON
MICROCYSTINEN
.
148
6.5
BESTIMMUNG
DER
NACHWEISGRENZE
MIT
ANTIKOERPER
MC10E7.
.
150
6.6
BESTIMMUNG
VON
KREUZREAKTIONEN
.
151
6.
7
MESSUNG
VON
REALPROBEN
.
152
6.8
ZUSAMMENFASSUNG
UND
SCHLUSSFOLGERUNGEN
.
154
7
UEBERTRAGUNG
DES
MLCROCYSTIN-LMMUNOASSAYS
IN
EIN
SENSORTAUGLICHES
F
ORMAT
.
155
8
M
ASSENSPEKTROMETRISCHE
D
ETEKTION
DER
M
ICROCYSTINE
.
159
8.1
AUSWAHL
EINES
GEEIGNETEN
MASSENSPEKTROMETERS
.
159
8.2
AUFBAU
UND
FUNKTIONSWEISE
DES
MASSENSPEKTROMETERS
.
160
8.3
OPTIMIERUNG
DER
BEDINGUNGEN
.
162
8.4
DETEKTION
VON
MICROCYSTINEN
MITTELS
ESI-TOF
.
165
8.5
MESSUNG
VON
REALPROBEN
.
171
8.6
FRAGMENTIERUNG
VON
MICROCYSTINEN
.
173
8.7
ANALYTIK
VON
MICROCYSTINEN
MITTELS
HPLC-ESI-MS-KOPPLUNG
.177
8.8
MOLMASSENBESTIMMUNG
VON
PROTEINEN
UND
HAPTEN-PROTEIN-KONJUGATEN
MITTELS
ESI-TOF.
.
181
8.9
ZUSAMMENFASSUNG
UND
SCHLUSSFOLGERUNGEN
.
185
9
O
N
-
LINE
-SPE-HPLC-MS-UV-M
ETHODE
ZUR
M
ESSUNG
VON
M
ICROCYSTINEN
.
186
9.1
A
UJBAU
DER
APPARATUR
.186
9.2 OPTIMIERUNG
DER
PARAMETER
.
188
9.2.1
AUSWAHL
DER
ANREICHERUNGSKARTUSCHE
.
188
9.2.2
OPTIMIERUNG
DER
FESTPHASENEXTRAKTION
.
189
9.2.3
KOPPLUNG
DER
FESTPHASENEXTRAKTION
AN
DIE
CHROMATOGRAPHISCHE
TRENNUNG
.
193
9.2.4
MESSUNG
VON
REALPROBEN
.
196
I
NHALTSVERZEICHNIS
V
9.3
ZUSAMMENFASSUNG
UND
SCHLUSSFOLGERUNGEN
.
198
IV.
Z
USAMMENFASSUNG
.
200
V.
A
USBLICK
.
204
VI.
E
XPERIMENTELLER
T
EIL
.
205
1
V
ERWENDETE
G
ERAETE
.
205
2
C
HEMIKALIEN
UND
R
EAGENZIEN
.
206
2.1
VERWENDETE
CHEMIKALIEN
.
206
2.2
STANDARDSUBSTANZEN
.
208
2.3
VERZEICHNIS
DER
ANTIKOERPER
UND
TRACER.
209
2.4
PUFFER-
UND
STAMMLOESUNGEN
.
209
3
V
ORSCHRIFTEN
ZUR
I
MMUNISIERUNG
UND
H
ERSTELLUNG
VON
MONOKLONALEN
A
NTIKOERPERN
.
212
3.1
HERSTELLUNG
DES
MONOKLONALEN
MC10E7-ANTIKOERPERS
.212
3.1.1
IMMUNISIERUNG
.
212
3.1.2
FUSION
UND
REKLONIERUNG
.
212
3.1.3
SCREENING
DER
ZELLKULTURUEBERSTAENDE
.
212
3.2
HERSTELLUNG
DES
MONOKLONALEN
AD4G2-ANTIKOERPERS
.
213
3.2.1
IMMUNISIERUNG
.
213
3.2.2
FUSION
UND
REKLONIERUNG
.
213
3.2.3
INDIREKTER
KOMPETITIVER
ELISA
ZUM
TESTEN
DER
SEREN
VON
V-ACETYL-ADDA-KLH-IMMUNISIERTEN
MAEUSEN
.
214
3.2.4
SCREENING
DER
ZELLKULTURUEBERSTAENDE
.
214
4
S
TANDARDPROZEDUREN
.
214
4.1
ANSETZEN
VON
ANALYTSTANDARDS
.
214
4.2
DIREKTER
KOMPETITIVER
ELISA
FUER
DIE
ANTIKOERPER
M8H5,
MC10E7
UNDAD4G2
.
215
4.3
BESTIMMUNG
VON
REALPROBEN
IM
ELISA
.
216
4.4
OPTIMIERUNG
DER
ANTIKOERPER
UND
TRACERKONZENTRATION
UND
BESTIMMUNG
DER
AFFINITAETSKONSTANTEN
.
217
4.5
PROTEINPHOSPHATASE-INHIBITIONSASSAYFUER
HPLC-KOPPLUNG
.
217
VI
5
S
YNTHESEN
UND
S
PALTUNGSEXPERIMENTE
.
218
5.7
SYNTHESEN
VON
MICROCYSTIN-LR-IMMUNOGENEN
UND-TRACERN
.
218
5.1.1
HERSTELLUNG
DES
MICROCYSTIN-LR-POD-TRACERS
.
218
5.1.2
HERSTELLUNG
DES
MICROCYSTIN-LR-KLH-KONJUGATES
.
218
5.1.3
SYNTHESE
VON
KATIONISIERTEM
OVALBUMIN
(COVA)
.
219
5.1.4
SYNTHESE
DES
LOESLICHEN
MICROCYSTIN-LR-COVA-KONJUGATES
.
219
5.1.5
SYNTHESE
DES
UNLOESLICHEN
MICROCYSTIN-LR-COVA-KONJUGATES
.
220
5.2
SYNTHESE
VON
ADDA-DERIVATEN,
-IMMUNOGENEN
UND
-TRACERN
.220
5.2.1
SYNTHESE
VON
IV-ACETYL-ADDA
.
220
5.2.2
SYNTHESE
DES
AKTIVIERTEN
NHS-ESTERS
VON
JV-ACETYL-ADDA.
221
5.2.3
SYNTHESEN
DER
N-ACETYL-ADDA-KLH-,
-BSA
UND
-POD
KONJUGATE
.
221
5.3
ENZYMATISCHE
SPALTEXPERIMENTE
VON
MICROCYSTIN-LR
.
222
5.4
KOPPLUNG
VON
MICROCYSTIN-LR
AN
AMINOMODIFIZIERTE
GLASTRAEGER.
.
222
6
C
HROMATOGRAPHISCHE
M
ETHODEN
.
223
6.1
OFF-LINE-FESTPHASENEXTRAKTION
GEFRIERGETROCKNETER
CYANOBAKTERIEN
.
223
6.2
HPLC-UVD,
HPLC-ELISA
UNDHPLC-MS
.
223
7
M
ASSENSPEKTROMETRIE
(MS)
.
225
7.
1
MS-PARAMETER
UND
MASSENKALIBRIERUNG
.
225
7.2
ON-LINE-SPE-HPLC-MS
.
227
7.2.1
PROBENVORBEREITUNG
.
227
7.2.2
ANREICHERUNGSPROGRAMM
.
227
7.2.3
ELUTIONSPROGRAMM
.
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VII.
A
BKUERZUNGEN
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VIII.
L
ITERATUR
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