Entwicklung eines chemilumineszenzbasierten Microarrays zur Detektion von allergenspezifischem IgE:
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| Sprache: | German |
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München
Hieronymus
2003
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| Schriftenreihe: | Chemie
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| adam_text | Inhaltsverzeichnis
I. Einleitung l
II. Theoretische Grundlagen 2
1 Allergene 2
/./ Natürliche Allergene 2
1.2 Herstellung und Charakterisierung von Allergenextrakten 4
7.5 Rekombinante Allergene 9
1.4 Kreuzreaktivitäten zwischen verschiedenen Allergenen 10
1.4.1 Sequenzhomologien zwischen A llergenen 10
1.4.2 Kreuzreagierende Kohlenhydrat Determinanten (CCD) 11
7.5 Warum sind Allergene Allergene ? 12
2 Allergologische Grundlagen 13
2.1 Historisches 13
2.2 Immunoglobulinklassen 13
2.3 Mechanismus der Allergieauslösung 14
3 Diagnostische Verfahren für allergische Erkrankungen 16
3.1 In vivo AUergiediagnostik 16
3.2 In vitro Allergiediagnostik 17
3.2.1 Bestimmung des Gesamt IgE Gehaltes 17
3.2.2 Bestimmung des allergenspezifischen IgE Gehaltes 18
3.2.3 Immunoblot Technik 19
3.2.4 Basophilen Degranulation in vitro Histaminfreisetzung 20
3.2.5 Bestimmung des Tryptasegehaltes 20
3.3 Testverfahren zur Bestimmung des allergenspeziflschen IgE Gehaltes 21
3.3.1 Verwendete Trägermaterialien 21
3.3.2 Modifizierung von Trägermaterialien fiir die Allergenankopplung 22
3.3.3 Anti Human IgE Antikörper 22
3.3.4 Kalibrierstandards und Testprozedur 23
3.3.5 Markierung der Antikörper 23
3.3.6 Detektionsprinzipien 24
i. Vergleich verschiedener Allergietests 24
5.5 Bewertung der in vitro Allergiediagnostik 29
4 Miniaturisierung 31
5 Herstellung von Microlirrays 34
5.1 Trägermaterialien 34
5.2 Aktivierung von Oberflächen 35
5.2.1 Allgemeines 35
5.2.2 Methoden der Oberflächenaktivierung 38
5.2.3 Sonstige Methoden zur Oberflächenaktivierung 42
5.3 Qualitätskontrolle chemisch modifizierter Oberflächen 43
5.4 Immobilisierung der Reagenzien 43
5.4.1 Kommerzielle Systeme 43
5.4.2 Sonstige Methoden zur miniaturisierten Immobilisierung von 46
Reagenzien
5.5 Problematik der Tropfengröße 47
6 Sensorprinzipien 48
6.1 Allgemeines 48
6.2 Automatische Zudosierung der Reagenzien 48
6.3 Direkte Messung Markierungsfreie Methoden 50
6.3.1 Surface Plasmon Resonance (SPR) 50
6.3.2 Piezoelektrische Sensoren 51
6.3.3 Surface EnhancedLaser Desorption Ionisation 51
6.4 Indirekte Messung Sensoren mit markierten Antikörpern 52
6.4.1 Fluoreszenz und Chemilumineszenzmessungen 52
64.2 Planar Wave Guide Technologie 53
6.4.3 Bead Based Assays Durchflusscytometrie 54
7 Der paraUele Afflnitäts Sensor Array (PASA System) 55
III. Motivation und Zielsetzung 59
IV. Ergebnisse und Diskussion 60
1 Leistungsfähigkeit des PASA Systems 60
/./ CCD Chip 60
1 2 Automatisches System zur Zudosierung der Reagenzien 6°
13 Sensitivität des PASA Systems 64
2 Charakterisierung des Microarray Spotters 65
2.1 Piezoelektrischer Microarray Spotter der Firma GeSiM 65
2.2 Vergleich unterschiedlicher Microarray Spotter 66
2.3 Evaluierung einer geeigneten Spotgröße 68
3 Durchführung der Referenzmessungen 72
4 Vortests mit kommerziellen Extrakten in der MTP 74
4.1 Allergietest in der MTP 74
4.2 Vergleich zwischen direkter und indirekter Immobilisierung 75
5 Herstellung der Extraktlösungen 77
5.7 Ermittlung geeigneter Extraktionsbedingungen 77
5.2 Charakterisierung verschiedener Birkenpollenextraktlösungen 78
5.3 Charakterisierung weiterer Baum und Graspollenextraktlösungen 82
5.4 Biotinylierung der Allergenextrakte 83
5.5 Nahrungsmittelextrakte 84
5.5.7 Nuss , Apfel und Sellerieextrakte 84
5.5.2 Gereinigte Nahrungsmittelallergene 87
5.6 Sonstige Allergenextrakte 89
5.6.7 Extrakteßr die Diagnose einer Bienengiftallergie 89
5.6.2 Extrakteför die Diagnose einer Katzenallergie 89
5.6.3 Extrakte für die Diagnose einer Milbenallergie 90
5.6.4 Extrakte für die Diagnose einer Schimmelpillallergie 91
5.7 Zusammenfassung 92
6 Herstellung der Microarrays 93
6.7 Chemische Reinigung der Glasträger 93
6.2 Silanisierung der Glasobjektträger 93
6.2.7 Oberflächen zur Physisorption 93
6.2.2 Enzymatische Ankopplung mit MTGase 94
6.2.3 Aminosilanisierte Oberflächen 95
6.2.4 Oberflächen zur kovalenten Ankopplung 97
6.3 Spotstruktur auf unterschiedlichen Oberflächen 102
6.4 SignalinUnsität für Betvl auf unterschiedlichen Oberflächen 106
6.5 Evaluierung der geeigneten Oberflächenchemie anhand eines Allergietests 107
6.6 Silanisierung von Goldoberflächen Self Assembled Monolayers 109
7 Entwicklung einer geeigneten Testprozedur 110
7.1 Testdurchführung uo
7.2 Vergleich zwischen Inkubation in PASA Anlage und mit Chamber Slides 112
7.3 Kinetik der Testdurchführung 114
7.4 Geeignete Temperatur für die Seruminkubation 115
7.5 Etablierung einer Referenzmessung 116
7.6 Kreuzreaktionen auf dem Chip 118
8 Ergebnisse der Messungen auf GOPS modifizierten Objektträgern 120
8.1 Signalreduktion bei Glycerinzusatz 120
8.2 Signalintensitäten bei unterschiedlichen Zusätzen 123
8.3 Indirekte Immobilisierung von Extrakten 125
8.4 On Chip Biotinylierung 126
9 Durchführung von Allergietests auf GOPS Oberflächen 127
9.1 UnterscheidungAllergiker/Nichtallergiker 127
9.2 Bestimmung des Gesamt IgE Gehaltes und Kalibrierung des Testsystems 129
9.3 Schätzung der Nachweisgrenze 132
9.3.1 Allergenspezifisches IgE 132
9.3.2 Gesamt IgE 134
9.4 Inhibitionstests 135
9.5 Lagerfähigkeit eines Allergenchips 138
10 Konkurrenzreaktion zwischen allergenspezifischem IgE und IgG 139
10.1 Durchführung eines Allergietests mit Nahrungsmittelallergenen 139
10.2 Reduzierung des aüergenspezifischen IgG Signals durch Verdünnung 141
10.3 Vergleich der IgE /IgG Signale in Abhängigkeit von der Serumverdünnung 143
10.4 Eliminierung von IgG aus der Serumprobe 145
10.4.1 Bestimmung des Gesamt IgG Gehaltes 145
10.4.2 Entfernung von IgG aus Serumproben 147
11 Screening von Humanseren mit Multiallergenchips 154
11.1 Screening von drei verschiedenen Humanseren 154
11.2 Screening mit AUergenextrakten und rekombinanten Allergenen 155
11.3 Screening mit rekombinanten/gereinigten Allergenen 158
11.3.1 Auswahl positiver Seren anhand eines MTP Tests 158
11.3.2 Screening mit rekombinanten Allergenen aufGOPS 159
modifizierten Chips
11.3.3 Reproduzierbarkeit der Messungen 164
11.4 Screening mit 24/31 verschiedenen Allergenen 167
V. Zusammenfassung 172
VI. Ausblick 177
VII. EXPERIMENTALTEIL 179
1 Geräte 179
1.1 Sensoraußau 179
/././ CCD System 179
1.1.2 Automatisches System zur Dosierung der Reagenzien 179
1.2 Nanopipettiersystem (GeSiM GmbH, Großerkmannsdorf) 180
1.3 Sonstige 180
2 Verbrauchs Materialien 181
2.1 Allgemein 181
2.2 Mikrotiterplatten 181
2.3 Voraktivierte Objektträger 181
3 Chemikalien und Reagenzien 182
3.1 Chemikalien 182
3.2 Humanseren 184
3.3 Allergene 184
3.3.1 Rekombinante/Gereinigte Allergene 184
3.3.2 Rohmaterialien zur Herstellung von Allergenextrakten 185
3.3.3 Pricktests zur Herstellung von Allergenextrakten 185
3.3.4 Kommerzielle Allergenextraktlösungen 186
3.4 Antikörper 186
3.5 Konjugate 186
3.6 Speziaireagenzien 186
4 Puffer 187
4.1 Puffer für das Enzymlabel Peroxidase 187
4.2 Puffer für Blockinglösung der Objektträger 188
4.3 Puffer für Seruminkubation/Inkubation mit Detektionsantikörper (JP) 188
vi Inhaltsverzeichnis
5 Standardprozeduren: ELISA Tests in MTP 188
5.1 Sandwich Enzym Immunoassay Bestimmung des Gesamt IgE Gehaltes 188
5.2 Sandwich Enzym Immunoassay Bestimmung des Gesamt IgG Gehaltes 190
5.3 Sandwich Enzym Immunoassay Bestimmung des Bet vl Gehabes 190
5.4 Sandwich Enzym Immunoassay Bestimmung desDer pl Gehaltes 191
5.5 Direkter, nicht kompetitiver ELISA Bestimmung des allergenspeziflschen 192
IgE Gehaltes
5.6 Direkter, nicht kompetitiver ELISA Bestimmung des Gesamt IgG Gehaltes 192
5.7 Ankopplung von Proteinen an caseinbeschichtete MTP über Trans 193
glutaminase
5.7.1 Herstellung der Transglutaminaselösung 193
5.7.2 ELISA mit Transglutaminase Kopplung 193
5.8 Bestimmung der Nachweisgrenze von Peroxidase 193
6 Herstellung der Allergenextrakte 194
7 Bestimmung des Proteingehaltes der Allergenextrakte • 94
8 Eliminierung von IgG aus Serumproben 195
8.1 Protein G Tests 195
8.2 Behandlung des Humanserums mit Anti Human IgG AK 196
8.3 Behandlung des Humanserums mit gesättigter Ammoniumsulfatlösung 196
9 Biotinylierung von Allergenextrakten 196
10 ELISA Tests mit der PASA Anlage 197
10.1 Reinigung der Glasobjektträger 197
10.2 Silanisierung der Objektträger 198
10.2.1 Silanisierung von Glasoberflächen mit Trimethylchlorsilan 198
10.2.2 Silanisierung mit Phenyltriethoxysilan und mit Methyltrimethoxysilan 198
10.2.3 Aminosilanisierung von Glasoberflächen 198
10.2.4 Aktivierung aminosilanisierter Objektträger mit Glutaraldehyd 199
10.2.5 Silanisierung mit Mercaptopropyltrimethoxysilan 199
10.2.6 Silanisierung mit 3 Gfycidyloxypropyltrimethoxysilan 199
10.2.7 Silanisierung mit 3 (Triethoxysilyl)propylbernsteinsäureanhydrid, 2 (3,4)
Epoxy(cyclohexyl)ethyltrimethoxysilan, Ureidopropyl~trimethoxysilan 199
Inhaltsverzeichnis vii^
11 Piezoelektrischer Microarray Spotter 200
12 PASA System 200
12.1 Fokussierung der CCD Kamera 201
12.2 Reinigung des PASASystems 201
13 Durchführung von ELISA Tests auf modifizierten Glasobjektträgern 202
13.1 Allgemeines Vorgehen 202
13.2 Bestimmung des Gesamt und allergenspezifischen IgE Gehaltes 202
13.3 Bestimmung des allergenspezifischen IgG Gehaltes 203
13.4 Kalibrierung mit reinem Myeloma IgE 203
13.5 DNA Hybridisierung auf modifizierten Oberflächen 203
13.6 On Chip Biotinylierung 204
13.7 Ermittlung der Nachweisgrenzen 204
13.8 Bestimmung der Nachweisgrenze des Sensorsystems 204
13.9 Verwendung des Avidin Biotin Systems zur Bestimmung des allergen 205
spezifischen IgE Gehaltes
VIII. Literaturverzeichnis 206
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