Holdings: Stellung, Regulation und Funktion der PDE2 in humanen Endothelzellen

Stellung, Regulation und Funktion der PDE2 in humanen Endothelzellen:

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Main Author:	Thomas, Dirk (Author)
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Published:	2002
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Item Description:	Berlin, Humboldt-Univ., Diss., 2002
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adam_text	INHALTSVERZEICHNIS 1 EINLEITUNG --------------------------------------------------------------- - 1 1.1 ALLGEMEINE EINLEITUNG --------------------------------------------------------------- 1 1.2 DIE PHOSPHODIESTERASEN IN EINER UEBERSICHT -------------------------------------- 2 1.2.1 DIE PHOSPHODIESTERASE T YP 2 IN GENAUERER BETRACHTUNG ------------------ 6 1.2.2 DIE REGULATION DER PHOSPHODIESTERASE TYP 2 ------------------------------- 7 1.2.3 BISHER BEKANNTE FUNKTIO NEN DER PHOSPHODIESTERASE TYP 2 --------------- 8 1.3 REGULATIONSWEGE DER PD E2 -------------------------------------------------------- 9 1.3.1 UEBERBLICK UEBER DIE GRUPPE DER PROTEINKINASEN ----------------------------- 9 1.3.1.1 DIE MITOGEN-AKTIVIERTEN PROTEINKINASEN ABHAENGIGEN SIGNALWEGE ------------------------------------------- 10 1.3.1.2 DIE STRESS-AKTIVIERTEN PROTEINKINASEN ABHAENGIGEN SIGNALWEGE ----------------------------------------------------------- 12 1.4 ENDOTHELIALE PERMEABILIT AET --------------------------------------------------------- 15 1.4.1 ALLGEMEINE BETRACHTUNG ------------------------------------------------------- 15 1.4.2 METHODEN ZUR UNTERSUCH UNG VON ENDOTHELIALER PERMEABILITAET ---------- 16 1.4.3 REGULATION DER ENDOTHELI ALEN PERMEABILITAET - BEDEUTUNG DES ZYTOSKELETTS ----------- 17 1.4.4 WIRKUNG VON THROMBIN AUF ENDOTHELIALE PERMEABILITAET ------------------- 18 1.4.5 EINFLUSS DER ZYKLISCHEN N UKLEOTIDE AUF ENDOTHELIALE PERMEABILITAET ----- 18 1.5 GEFAESSNEUBILDUNG ALS WIE HTIGE ENDOTHELIALE AUFGABE ------------------------- 21 1.5.1 UEBERBLICK UEBER DAS THEMA ----------------------------------------------------- 21 1.5.2 MOLEKULARE MECHANISMEN DER GEFAESSNEUBILDUNG --------------------------- 22 1.5.3 DIE SIGNALTRANSDUKTION UND DIE BEDEUTUNG VON VEGF ------------------- 23 1.5.4 EINFLUSS DER ZYKLISCHEN N UKLEOTIDE AUF DIE GEFAESSNEUBILDUNG ----------- 29 1.6 FRAGESTELLUNGEN DER ARBE IT --------------------------------------------------------- 31 2 MATERIAL -------------------------------------------------------------------- 32 2.1 SPEZIELLE ZELLBIOLOGISCHE SUBSTANZEN --------------------------------------------- 32 2.2 PLASMIDE ------------------------------------------------------------------------------- 33 2.3 PCR-PRIMERPAARE -------------------------------------------------------------------- 33 2.4 ANTIKOERPER ----------------------------------------------------------------------------- 34 2.5 SONSTIGE CHEMIKALIEN ---------------------------------------------------------------- 35 2.6 ANTIBIOTIKA ---------------------------------------------------------------------------- 37 2.7 ENZYME -------------------------------------------------------------------------------- 37 2.8 KULTURMEDIEN ------------------------------------------------------------------------- 37 2.9 PUFFER UND LOESUNGEN ---------------------------------------------------------------- 38 2.10 GROESSENSTANDARDS DNA/P ROTEIN -------------------------------------------------- 43 2.11 ZUBEHOER ------------------------------------------------------------------------------- 43 2.12 SPEZIELLE GERAETE---------------------------------------------------------------------- 43 3 METHODEN------------------------------------------------------------------- 45 3.1 ZELLKULTUR ------------------------------------------------------------------------------ 45 3.1.1 HUMANE ENDOTHELZELLEN AUS DER NABELSCHNURVENE (HUVEC) ----------- 45 3.1.1.1 ISOLIERUNG ---------------------------------------------------------------------- 45 3.1.1.2 CHARAKTERISIERUNG ------------------------------------------------------------ 46 3.1.1.3 SPLITTEN ------------------------------------------------------------------------ 47 3.2 TRANSIENTE TRANSFEKTION HUMANER ENDOTHELZELLEN ------------------------------ 47 3.3 METHODIK DER RT-PCR --------------------------------------------------------------- 48 3.3.1 RNA-ISOLIERUNG ------------------------------------------------------------------ 48 48 3.3.2 REVERSE TRANSKRIPTION -------------- 3.3.3 POLYMERASE-KETTENREAKTION (PCR) ------------------------------------------- 49 3.4 KLONIERUNG UND TRANSFORMATION DER PDE2A3 ---------------------------------- 50 3.4.1 GEL-EXTRAKTION ------------------------------------------------------------------- 50 3.4.2 DER VEKTOR PCDNA3.1/HYGRO(-) ---------------------------------------------- 51 3.4.3 TRANSFORMATION DER LIGIERTEN PLASMIDE IN E. COLI -------------------------- 51 3.4.4 ENDOTOXINFREIE MAXIPRAEP ARATION VON PLASMIDEN --------------------------- 52 3.4.5 BESTIMMUNG DES PLASMIDGEHALTS --------------------------------------------- 52 3.4.6 RESTRIKTIONSVERDAU DER P LASMIDE --------------------------------------------- 52 3.5 PROTEINISOLIERUNG UND W ESTEM BLOT ---------------------------------------------- 53 3.5.1 ISOLIERUNG DER GESAMT-PROTEINE AUS HUVEC ------------------------------- 53 3.5.2 MODIFIKATION ZUR ISOLIERUNG VON PHOSPHORYLIERTEN PROTEINEN ------------ 53 3.5.3 GEWINNUNG VON ZELLKEMPROTEINEN ------------------------------------------- 53 3.5.4 BESTIMMUNG DER PROTEINKONZENTRATION - BRADFORD-TEST ------------------ 54 3.5.5 WESTERN BLOT --------------------------------------------------------------------- 55 3.5.6 ANFAERBEN DER PROTEINE AUF NITROCELLULOSE ----------------------------------- 56 3.5.7 ANTIKOERPERREAKTION -------------------------------------------------------------- 56 3.5.8 ECL-DETEKTION ------------------------------------------------------------------- 56 3.6 IMMUNFLUORESZENZMIKRO SKOPIE --------------------------------------------------- 57 3.7 CAMP/CGMP ENZYMIMMUNOASSAY ----------------------------------------------- 58 3.8 PHOSPHODIESTERASE AKTIVITAETSASSAY ------------------------------------------------ 59 3.9 INTERLEUKIN-8-ELISA ----------------------------------------------------------------- 61 3.10 ENDOTHELIALE MIGRATION ------------------------------------------------------------ 62 3.10.1 VORBEREITUNG DER FILTER -------------------------------------------------------- 62 3.10.2 BESTUECKUNG DER KAMMERN 62 3.10.3 FAERBUNG DER ZELLEN UND AUSWERTUNG DER MIGRATION ---------------------- 63 3.11 YYTUBE FORMATION " -ASSAY ---------------------------------------------------------- 63 3.11.1 VORBEREITUNG DES MATRIGELS UND DER PLATTEN ------------------------------- 63 3.11.2 EINFLILLEN DES MATRIGELS -------------------------------------------------------- 63 3.11.3 PFLANZEN DER ZELLEN UND GABE DER INHIBITOREN ---------------------------- 63 3.11.4 AUSWERTUNG DER YYTUBE FO RMATION " ------------------------------------------- 64 3.12 STATISTISCHE AUSWERTUNG ----------------------------------------------------------- 64 4 ERGEBNISSE------------------------------------------------------------------- 65 4.1 DAS PHOSPHODIESTERASE PROFIL IN HUVEC -------------------------------------- 65 4.1.1 BETRACHTUNG DER BASALEN AKTIVITAET ------------------------------------------- 65 4.1.2 DIE INDUZIERBARKEIT DER P DE2 IN HUVEC ---------------------------------- 68 4.2 DIE UEBEREXPRESSION DER PDE2A3 IN HUVEC ---------------------------------- 76 4.3 DIE REGULATION DER PDE 2 ----------------------------------------------------------- 80 4.3.1 TNF A REGULIERT DIE EXP RESSION DER PDE2 UEBER P38MAPK -------------- 80 4.3.2 VEGF REGULIERT DIE EXPRESSION DER PDE2 UEBER ERK1/2 ------------------ 86 4.4 EINFLUSS DER PDE2 AUF DI E ENDOTHELIALE PERMEABILITAET ------------------------- 90 4.4.1 EINFLUSS DER UEBEREXPRESS I ON DER PDE2 AUF DIE HYDRAULISCHE KONDUKTIVITAET ----------------------------------------------------------- 90 4.4.2 EINFLUSS DER UEBEREXPRESS ION DER PDE2 AUF DAS F ACTIN GERUEST -------- 92 4.5 EINFLUSS DER PDE2 AUF P ROZESSE DER GEFAESSNEUBILDUNG ------------------------ 94 4.5.1 EINFLUSS DER PDE2 AUF EN DOTHELIALE MIGRATION ----------------------------- 94 4.5.2 EINFLUSS DER PDE2 AUF ENDOTHELIALE YYTUBE FORMATION " --------------------- 100 5 DISKUSSION ------------------------------------------------------------------ 104 5.1 DIE STELLUNG DER PDE2 INNERHALB DER PHOSPHODIESTERASEN -------------------- 104 5.2 TNF-A REGULIERT DIE TRANSKRIPTION DER PDE2 UEBER P38 MAPK ---------------------------------------------------------------------------- 107 5.3 VEGFISS REGULIERT PDE2 -EXPRESSION UEBER ERK !4 ----------------------------- 110 5.4 BESONDERHEITEN VON CGMP SIGNALVERMITTLUNG IN HUVEC ------------------- 113 5.5 DIE PDE2 TRAEGT ZUR REGULATION DER GEFAESSPERMEABILITAET BEI ------------------- 114 5.6 DIE PDE2 BEEINFLUSST PROZESSE DER GEFAESSNEUBILDUNG ------------------------- 117 5.7 DERZEITIGES GESAMTBILD DER PDE2 ------------------------------------------------- 119 6 ZUSAMMENFASSUNG-------------------------------------------------------- 121 7 LITERATURVERZEICHNI S ----------------------------------------------------- 123 ANHANG
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