Melanomspezifische Genexpression und Signaltransduktion bei Xiphophorus: die Rolle des Transkriptionsfaktors Mitf
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2003
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Beschreibung: | Zsfassung in engl. Sprache. - Würzburg, Univ., Diss., 2003 |
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INHALTSVERZEICHNIS
INHALTSVERZEICHNIS
1 _
EINLEITUNG_ _I
1.1 KREBSENTSTEHUNG UND TRANSKRIPTIONSREGULATION.
1
1.2
XIPHOPHORUS ALS MODELLSYSTEM FUER MOLEKULARE TUMORGENETIK. 4
1.3 DER T RANSKRIPTIONSFAKTOR MITF. 10
1.4 ZIELSETZUNG.
13
2 _
MATERIAL_ 14
2.1 ZELLINIEN.
14
2.2 BAKTERIEN.
14
2.3 VEKTOREN.
15
2.4 OLIGONUKLEOTIDE.
15
2.5 ENZYME UND ENZYMKITS. 16
2.6 ANTIKOERPER. 16
2.7 CHEMIKALIEN UND RADIOCHEMIKALIEN. 17
2.8 MEDIEN UND PUFFERLOESUNGEN. 18
2.9 GERAETE. 18
3 _
METHODEN_ 20
3.1 DNA-KLONIERUNGSTECHNIKEN. 20
3.1.1 PRAEPARATION VON PLASMID-DNA AUS
E.COLI. 20
3.1.2 PCR (POLYMERASE CHAIN REACTION). 21
3.1.3 SPALTUNG VON DNA MIT RESTRIKTIONSENDONUKLEASEN. 21
3.1.4 AUFFUELLEN UEBERHAENGENDER 5'-ENDEN MIT KLENOW-POLYMERASE. 22
3.1.5 DEPHOSPHORYLIERUNG VON DNA-ENDEN. 22
3.1.6 PHOSPHORYLIERUNG VON DNA-ENDEN. 22
3.1.7 LIGATION VON DNA. 23
BIBLIOGRAFISCHE INFORMATIONEN
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INHALTSVERZEICHNIS
3.1.8 TRANSFORMATION KOMPETENTER BAKTERIEN. 23
3.1.9 KLONIERUNGEN. 25
3.1.9.1 KLONIERUNG VERSCHIEDENER LUC+REPORTERGEN-KONSTRUKTE. 25
3.1.9.2 KLONIERUNG EINES XMITF-M EXPRESSIONSPLASMIDS.
27
3.2 DNA-GELELEKTROPHORESE. 28
3.2.1 AGAROSE-GELELEKTROPHORESE. 28
3.2.2 POLYACRYLAMID-GELELEKTROPHORESE. 29
3.2.3 ISOLIERUNG VON DNA-FRAGMENTEN. 29
3.3 RADIOAKTIVE MARKIERUNG VON DNA. 30
3.3.1 3'-ENDMARKIERUNG. 30
3.3.2 PRIMER-ENDLABELLING. 30
3.4 RACE-EXPERIMENTE (RAPID AMPLIFICATION OF CDNA ENDS). 30
3.4.1 3'RACE. 30
3.4.2 5'RACE. 31
3.5 SEQUENZANALYSE VON DNA. 32
3.6 ZELLKULTUR UND ZELLAUFSCHLUSSVERFAHREN. 32
3.6.1 KULTIVIERUNG EUKARYONTISCHER ZELLEN. 32
3.6.2 DNA-TRANSFER IN EUKARYONTISCHE ZELLEN MITTELS KALZIUM-
PHOSPHAT-METHODE. 33
3.6.3 AUFSCHLUSS EUKARYONTISCHER ZELLEN. 34
3.6.4 LUCIFERASE-AKTIVITAETSBESTIMMUNG NACH DNA-TRANSFER. 35
3.7 ANALYSE VON PROTEINEN. 36
3.7.1 PROTEINBESTIMMUNG. 36
3.7.2 DENATURIERENDE SDS-POLYACRYLAMID GELELEKTROPHORESE. 36
3.7.3 WESTERN-BLOT-ANALYSE. 37
3.8 DNA-PROTEIN-BINDUNGSSTUDIEN. 39
INHALTSVERZEICHNIS
4_
ERGEBNISSE_ 40
4.1 CHARAKTERISIERUNG DES TRANSKRIPTIONSFAKTORS MITF. 40
4.1.1 SEQUENZANALYSEN.
40
4.1.1.1 VERGLEICHENDE CHARAKTERISIERUNG VON XMITF-B UND XMITF-M. 41
4.1.1.2 SEQUENZANALYSEN IM VERGLEICH MIT ANDEREN SPEZIES UND
CHARAKTERISIERUNG DES EVOLUTIONAEREN URSPRUNGS DER GENE.
45
4.1.2 CHARAKTERISIERUNG VON XMITF-M.
48
4.1.2.1 ANALYSE VON XMITF-M NACH TRANSIENTER EXPRESSION IN
XIPHOPHORUS
MELANOMZELLEN. 48
4.1.2.2 ANALYSE VON XMITF-M NACH TRANSIENTER EXPRESSION IN
SAEUGERZELLEN. 49
4.2 UNTERSUCHUNGEN ZUR MELANOMSPEZIFISCHEN TRANS
KRIPTIONSAKTIVIERUNG IN
XIPHOPHORUS. 52
4.2.1 IDENTIFIZIERUNG MELANOMSPEZIFISCHER C/'S-REGULATORISCHER
BEREICHE IM TYROSINASEPROMOTOR VON MEDAKA (
ORYZIAS LATIPES). 52
4.2.2 ANALYSE POTENTIELLER BINDUNGSSTELLEN FUER MITF.
54
4.2.2.1 NACHWEIS VON DNA/PROTEIN KOMPLEXEN MITTELS EMSA.
54
4.2.2.2 FUNKTION DER MITF-BINDUNGSSTELLEN IM MEDAKA TYROSINASEPRO
MOTOR FUER DIE MELANOMSPEZIFISCHE TRANSKRIPTIONSAKTIVIERUNG. 56
4.2.3 EINFLUSS DES TRANSKRIPTIONSFAKTORS MITF-M AUF DEN MEDAKA
TYROSINASEGENPROMOTOR. 60
4.2.3.1 COEXPRESSION DES TYROSINASEPROMOTORS UND XMITF-M IN
XIPHOPHORUS
FIBROBLASTEN. 60
4.2.3.2 COEXPRESSION DES TYROSINASEPROMOTORS UND XMITF-M IN
SAEUGERZELLEN. 62
4.2.4 UNTERSUCHUNGEN ZUR ROLLE VON MITF IN DER SIGNALTRANSDUKTION. 63
INHALTSVERZEICHNIS
5 _
DISKUSSION_ 55
5.1 EVOLUTION DER
MITF GENE.
55
5.2 UNTERSUCHUNGEN ZUR MELANOMSPEZIFISCHEN TRANSKRIPTIONS
AKTIVIERUNG IN
XIPHOPHORUS.
68
5.2.1 SPEZIFISCHE AKTIVIERUNG DES TYROSINASEPROMOTERS VON MEDAKA
IN MELANOMZELLEN.
68
5.2.2 DIE ROLLE VON MITF IN MELANOMSPEZIFISCHER TRANSKRIPTIONS
AKTIVIERUNG.
72
5.3 MITF ALS WICHTIGES REGULATORISCHES ELEMENT IN DER SIGNAL
KASKADE.
74
6 _
ZUSAMMENFASSUNG_ 76
7 _
SUMMARV_ 79
8 _
ABKUERZUNGEN_ 81
9 _
LITERATUR_ 84
10 _
PUBLIKATIONEN_ 95
11 _
DANKE!_ 96
12 _
LEBENSLAUF_97
13
_EIDESSTATTLICHE ERKLAERUNG_ 98 |
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