Der Translationsfaktor SelB: Mechanismus der UGA-Dekodierung und Funktion in der Regulation der Genexpression
Gespeichert in:
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2002
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INHALTSVERZEICHNIS
EINLEITUNG
.
1
1.
SELENMETABOLISMUS
IN
ESCHERICHIA
COLI
.
2
2.
DIE
GTPASE-SUPERFAMILIE
.
6
3.
GTPASEN
DES
BAKTERIELLEN
TRANSLATIONSAPPARATS
.
8
INITIATIONSFAKTOR
2
.
9
ELONGATIONSFAKTOR
TU
.
10
ELONGATIONSFAKTOR
G
.
12
TERMINATIONSFAKTOR
3
.
13
ELONGATIONSFAKTOR
SELB
.
14
4.
ZIELE
DIESER
ARBEIT
.
17
MATERIAL
UND
METHODEN
.
18
1.
STAEMME
UND
PLASMIDE
.
18
2.
MEDIEN
UND
SUPPLEMENTE
.
21
3.
OLIGONUKLEOTIDE
.
22
4.
CHEMIKALIEN,
BIOLOGISCHES
MATERIAL
UND
ENZYME
.
24
S.
MIKROBIOLOGISCHE
METHODEN
.
24
ANZUCHT
VON
BAKTERIEN
.
24
TEST
AUF
GASPRODUKTION
.
25
6.
GENETISCHE
METHODEN
.
25
TRANSFORMATION
.
25
HOMOLOGE
REKOMBINATION
.
26
GENETISCHE
MANIPULATION
UND
LYSOGENE
INTEGRATION
VON
X-PHAGEN
.
26
7.
MOLEKULARGENETISCHE
METHODEN
.
27
ISOLIERUNG
VON
PLASMID-DNA
.
27
ISOLIERUNG
VON
CHROMOSOMALER
DNA
.
27
STANDARDMETHODEN
.
27
ASSEMBLIERUNG
VON
OLIGONUKLEOTIDEN
.
27
POLYMERASE-KETTENREAKTION
.
28
SEQUENZIERUNG
VON
DNA
.
28
8.
METHODEN
ZUR
ANALYSE
VON
RNA
.
28
ISOLIERUNG
VON
GESAMT-RNA
.
28
IN
VZZRA-TRANSKRIPTION
VON
RNA
.
28
REINIGUNG
VON
TRNA
SEC
.
29
5'-MARKIERUNG
VON
RNA
.
29
INHALTSVERZEICHNIS
FALTUNG
VON SECIS-ELEMENTEN
.
30
BESTIMMUNG
DER
KONZENTRATION
VON
RNA-OLIGONUKLEOTIDEN
.
30
9.
REINIGUNG
UND
QUANTIFIZIERUNG
VON
PROTEINEN
.
31
REINIGUNG
DER
SERYL-TRNA
SYNTHETASE
.
31
REINIGUNG
DER
SELENOPHOSPHAT
SYNTHETASE
.
32
REINIGUNG
DES
ELONGATIONSFAKTORS
SELB
.
33
REINIGUNG
VON
SELB
HLS
.
34
REINIGUNG
VON
SEI
B
H
IS
-
VARIANTEN
.
34
REINIGUNG
VON
SELB
4
72.6I4
.
34
REINIGUNG
VON
SELB
37
9.6I4
.
35
BESTIMMUNG
DER
KONZENTRATION
VON
PROTEINEN
.
35
10.
ELEKTROPHORETISCHE
METHODEN
.
36
ELEKTROPHORESE
VON
DNA
.
36
ELEKTROPHORESE
VON
RNA
.
36
ELEKTROPHORESE
VON
PROTEINEN
.
36
11.
WESTERN
BLOT
.
37
12.
SPEKTROSKOPISCHE
METHODEN
.
37
CD-SPEKTROSKOPIE
.
37
FLUORESZENZ-SPEKTROSKOPIE
.
38
STOPPED-FLOW
ANALYSEN
.
38
13.
BIOCHEMISCHE
METHODEN
.
39
LIMITIERTE
PROTEOLYSE
.
39
BESTIMMUNG
VON
SS-GALACTOSIDASE-AKTIVITAETEN
.
39
AMINOACYLIERUNG
VON
TRNA
SEC
.
39
KONVERSION
VON
SERYL-TRNA
SCC
ZU
SELENOCYSTYL-TRNA
8
"
.
40
HYDROLYSESCHUTZ-EXPERIMENTE
.
40
QUANTIFIZIERUNG
VON
RADIOAKTIV
MARKIERTER
AMINOACYL-TRNA
.
40
ANALYSE
VON
SELB-LIGANDEN
INTERAKTIONEN
IM
GELRETARDATIONS-ASSAY
.
41
S
1
-NUKLEASESCHUTZ-EXPERIMENTE
.
41
14.
BIOINFORMATISCHE
METHODEN
.
42
AUSWERTUNG
VON
CD-SPEKTREN
.
42
BILDVERARBEITUNG
.
42
DARSTELLUNG
VON
3D-STRUKTUREN
.
43
SEQUENZANALYSEN
.
43
ANALYSE
VON
AUTORADIOGRAMMEN
.
43
ANALYSE
MATHEMATISCHER
DATEN
.
43
ERGEBNISSE
.
44
1.
SYSTEM
ZUR
EFFIZIENTEN
CHARAKTERISIERUNG
VON
MUTIERTEN
SELB-PROTEINEN
.
44
VORBEREITENDE
KLONIERUNGEN
.
44
KONSTRUKTION
VON
PT7SELBH6
.
45
KONSTRUKTION
VON
PMT7
UNDPMB
.
46
REINIGUNG
DES
SELB
H
I
S
-FUSIONSPROTEINS
.
48
INHALTSVERZEICHNIS
CHARAKTERISIERUNG
DES
SELB
H
I
S
-FUSIONSPROTEINS
.
49
BIOLOGISCHE
AKTIVITAET
.
49
ANALYSE
DER
SEKUNDAER
UND
TERTIAERSTRUKTUR
.
50
LIMITIERTE
PROTEOLYSE
.
50
CD-SPEKTROSKOPIE
.
51
ANALYSE
DER
BIOCHEMISCHEN
EIGENSCHAFTEN
.
51
BINDUNG
VON
GUANOSIN-NUKLEOTIDEN
.
52
INTERAKTION
MIT
SECIS-ELEMENTEN
.
52
INTERAKTION
MIT
SELENOCYSTEYL-TRNA
S
"
.
53
2.
DETERMINANTEN
DER
AMINOSAEURESPEZIFITAET
VON
SELB
.
54
GERICHTETE
MUTAGENESE
DER
AMINOACYL-BINDETASCHE
VON
SELB
.
54
EINFUHREN
DER
MUTATIONEN
.
56
AKTIVITAET
DER
MUTIERTEN
SELB-PROTEINE
IN
VIVO
.
57
ISOLIERUNG
UND
CHARAKTERISIERUNG
VON
SELB-VARIANTEN
MIT
VERAENDERTER
AMINOSAEURESPEZIFITAET
60
SELEKTION
.
60
AKTIVITAET
DER
SELEKTIERTEN
SELB
VARIANTEN
.
61
REINIGUNG
DER
SELB-VARIANTEN
.
63
BIOCHEMISCHE
CHARAKTERISIERUNG
DER
SELB-VARIANTEN
.
64
ANALYSE
DER
TERTIAERSTRUKTUR
.
64
INTERAKTION
MIT
SECIS-ELEMENTEN
.
65
INTERAKTION
MIT
SERYL
UND
SELENOCYSTEYL-TRNA
SEC
.
66
3.
QUANTITATIVE
ANALYSE
DER
INTERAKTION
VON
SELB
MIT
SEINEN
LIGANDEN
.
68
PRAEPARATION
VON
ENZYMEN
UND
RNA-SUBSTRATEN
.
69
REINIGUNG
VON
PROTEINEN
.
70
OPTIMIERUNG
DER
REINIGUNG
VON
SELB
.
70
REINIGUNG
VON
SELBAVS-EU
.
71
REINIGUNG
WEITERER
ENZYME
.
73
PRAEPARATION
VON
SELENOCYSTEYL-TRNA
SEC
.
74
PRAEPARATION
UND
FALTUNG
VON
SECIS-ELEMENTEN
.
74
EINFLUSS
DER
LIGANDENBINDUNG
AUF
DIE
SEKUNDAERSTRUKTUR
VON
SELB
.
76
PRINZIP
DER
STOPPED-FLOW-METHODE
.
77
ANALYSE
DER
INTERAKTION
VON
SELB
MIT
GUANOSIN-NUKLEOTIDEN
.
78
INTERAKTION
MIT
MANTDGTP
UND
GTP
.
78
INTERAKTION
MIT
MANTGDP
UND
GDP
.
82
ANALYSE
DER
INTERAKTION
VON
SELB
MIT
SECIS-ELEMENTEN
.
84
KINETISCHE
CHARAKTERISIERUNG
DER
INTERAKTION
MIT
DER
FDHF
-MINIHELIX
.
84
EINFLUSS
DER
STRUKTUR
DES
SECIS-ELEMENTS
AUF
DIE
AFFINITAET
FUER
SELB
.
88
KOORPERATIVITAET
DER
LIGANDEN-BINDUNG
DURCH
SELB
.
89
INTERAKTION
ZWISCHEN
DER
NUKLEOTID
UND
DER
SECIS-BINDETASCHE
.
89
INTERAKTION
ZWISCHEN
DER
SECIS
UND
DER
TRNA
SEC
-BINDETASCHE
.
90
INTERAKTION
ZWISCHEN
DER
NUKLEOTID
UND
DER
TRNA
SEC
-BINDETASCHE
.
92
4.
REGULATION
DER
SELENOCYSTEIN-BIOSYNTHESE
.
94
ORGANISATION
DES
RE/AB-TRANSKRIPTS
.
94
INTERAKTION
VON
SELB
MIT
DEM
SECIS-AEHNLICHEN
ELEMENT
.
95
REGULATION
DER
EXPRESSION
VON
SEL-GENEN
.
99
KONSTRUKTION
VON
STAEMMEN
MIT
DELETIONEN
IN
SEL-GENEN
.
99
REGULATION
DER
EXPRESSION
VON
SELA,
SELB
UND
SELD
.
100
INHALTSVERZEICHNIS
REGULATORISCHE
FUNKTION
DES
SECIS-AEHNLICHEN
ELEMENTS
.
101
KONSTRUKTION
VON
REPORTERGEN-FUSIONEN
.
101
EINFLUSS
DES
SECIS-AEHNLICHEN
ELEMENTS
AUF
DIE
EXPRESSION
VON
SEID
UND
SELB
.
103
EFFEKT
DES
SECIS-AEHNLICHEN
ELEMENTS
AUF
DIE
SYNTHESE
UND
STABILITAET
DER
SE/ASS-MRNA
.
105
FUNKTIONALITAET
DES
SECIS-AEHNLICHEN
ELEMENTS
.
107
DISKUSSION
.
109
1.
BIOCHEMIE
DER
LIGANDENBINDUNG
DURCH
SELB
.
109
MECHANISMUS
DER
SELENOCYSTEIN-SPEZIFITAET
.
109
ROLLE
DER
AMINOACYL-BINDETASCHE
.
110
SELEKTION
VON
SELENOCYSTEYL-TRNA
SEC
:
EIN
KOMPLEX
REGULIERTER
PROZESS
.HO
KINETIK
DER
INTERAKTION
MIT
GUANOSIN-NUKLEOTIDEN
.
113
INTERAKTION
MIT
DEM
SECIS-ELEMENT
.
115
KOOPERATIVITAET
DER
LIGANDENBINDUNG
.
115
2.
REGULATION
DER
SELENOCYSTEIN-BIOSYNTHESE
DURCH
SELB:
EIN
NEUARTIGER
MECHANISMUS
TRANSLATIONELLER
KONTROLLE
.
118
EIGENSCHAFTEN
DES
SECIS-AEHNLICHEN
ELEMENTS
.
118
MECHANISMUS
DER
REGULATION
.
120
MODELL
DES
REGULATORISCHEN
NETZWERKS
.
121
ZUSAMMENFASSUNG
.
125
LITERATURVERZEICHNIS
.
127 |
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