Proteomanalyse in oxidativ geschädigten Mitochondrien:
Gespeichert in:
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Format: | Buch |
Sprache: | German |
Veröffentlicht: |
2001
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Beschreibung: | Magdeburg, Univ., Diss., 2002 |
Beschreibung: | 56 Bl. Ill., graph. Darst. : 30 cm |
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INHALTSVERZEICHNIS
1.
EINLEITUNG SEITE
1.1. PROTEOMANALYSE 1
1.2. OXIDATIVER STRESS 4
1.3. PROTEINOXIDATION 7
1.4. METHODEN ZUR DETEKTION DER PROTEINOXIDATION MIT 2D-ELEKTROPHORESE 7
1.5. ZIEL DER ARBEIT 9
2. MATERIAL UND METHODEN
2.1. MATERIAL
11
2.2. EXPERIMENTEILE MODELLE
11
2.2.1. MITOCHONDRIENPRAEPARATION AUS RATTENLEBER 11
2.2.2. INDUKTION DER PEROXIDATION VON MITOCHONDRIEN DURCH EISEN /
ASCORBAT 12
2.2.3. HYPOXIE / REOXYGENIERUNG VON MITOCHONDRIEN 13
2.3. METHODEN ZUR CHARAKTERISIERUNG DER PRAEPARIERTEN MITOCHONDRIEN
13
2.3.1. MESSUNG DER AKTIVEN MITOCHONDRIALEN ATMUNG 13
2.3.2. MESSUNG DES PROTEINGEHALTES 13
2.4. QUANTITATIVE BESTIMMUNG VON MARKERN DES OXIDATIVEN STRESSES
14
2.4.1. BESTIMMUNG DER GEHALTE PROTEINGEBUNDENER CARBONYLGRUPPEN
MITTELS ELISA 14
2.4.2. BESTIMMUNG VON THIOBARBITURSAEURE-REAKTIVEN SUBSTANZEN (TBARS) 14
2.4.3. BESTIMMUNG VON GLUTATHION 15
2.5. SDS-POLYACRYLAMIDGELELEKTROPHORESE UND IMMUNOBIOTTING ZUR
DARSTELLUNG OXIDATIV MODIFIZIERTER PROTEINE
15
2.5.1. PROBENVORBEREITUNG FUER 2D-ELEKTROPHORESE 15
BIBLIOGRAFISCHE INFORMATIONEN
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2.5.2. ERSTE DIMENSION: ISOELEKTRISCHE FOKUSSIERUNG MIT IMMOBILISIERTEN
PH-GRADIENTEN 15
2.5.3. YYIM IEF-GEL"-DERIVATISIERUNG DER PROTEINGEBUNDENEN CARBONYLE MIT
2,4-DINITROPHENYLHYDRAZIN (DNPH) 16
2.5.4. ZWEITE DIMENSION: TRICIN SDS-PAGE 16
-STAMMLOESUNGEN UND GELHERSTELLUNG 16
2.5.5. DETEKTION VON PROTEINGEBUNDENEM DINITROPHENYLHYDRAZIN (DNPH)
DURCH IMMUNOBIOTTING 17
2.5.6. PROTEINFAERBUNG DURCH KOLLOIDAL-COOMASSIE 18
2.6. SCANNEN UND VERGLEICH DER GELE UND IMMUNOBLOTS
18
2.7. PROTEINIDENTIFIZIERUNG DURCH MALDI-MASSENSPEKTROMETRIE
(PEPTID-MASS FINGERPRINT)
19
2.8. STATISTISCHE AUSWERTUNG
20
3. ERGEBNISSE
3.1. DETEKTION VON PROTEINCARBONYLEN MITTELS 2D-ELEKTROPHORESE
21
3.1.1. DNPH-DERIVATISIERUNG IM LEF-GEL 21
3.1.2. VERGLEICH DER 2D-MUSTER EINES DNPH-BEHANDELTEN GELS UND EINES
-UNBEHANDELTEN STANDARDGELS 21
3.2. MITOCHONDRIENSCHAEDIGUNG DURCH EISEN / ASCORBAT-INDUZIERTEN
OXIDATIVEN STRESS
24
3.2.1. ZEITLICHER VERLAUF DER BILDUNG DNPH-REAKTIVER PROTEINCARBONYLE 24
3.2.2. ZEITLICHER VERLAUF DER BILDUNG VON THIOBARBITURSAEURE-REAKTIVEN
SUBSTANZEN (TBARS)
24
3.2.3. VERGLEICH DES ZEITLICHEN AUFTRETENS PROTEINGEBUNDENER CARBONYLE
MIT DEM ANSTIEG DER TBARS (THIOBARBITURSAEURE-REAKTIVE SUBSTANZEN) 27
3.2.4. ZWEIDIMENSIONALE ELEKTROPHORETISCHE DARSTELLUNG DER PROTEINMUSTER
OXIDATIV GESCHAEDIGTER MITOCHONDRIEN NACH EISEN / ASCORBAT-INKUBATION 27
3.2.5. DETEKTION OXIDATIV MODIFIZIERTER DNPH-REAKTIVER PROTEINE MITTELS
IMMUNOBIOTTING 30
3.3. HYPOXIE / REOXYGENIERUNG IN ISOLIERTEN RATTENLEBERMITOCHONDRIEN
31
3.3.1. VERAENDERUNGEN IN DER AKTIVEN ATMUNG UND BEI MARKERN DES
OXIDATIVEN
STRESSES IN ISOLIERTEN RATTENLEBERMITOCHONDRIEN DURCH HYPOXIE /
REOXYGENIERUNG 31
3.3.2. VERGLEICH DES CARBONYLGEHALTS DER PROTEINSPOTS ZWISCHEN KONTROLLE
UND HYPOXIE / REOXYGENIERUNG 33
3.3.3. ZWEIDIMENSIONALE ELEKTROPHORETISCHE DARSTELLUNG VON OXIDATIV
MODIFIZIERTEN PROTEINEN UND DETEKTION DER DNPH-REAKTIVEN PROTEIN-
CARBONYLE DURCH IMMUNOBIOTTING NACH HYPOXIE / REOXYGENIERUNG 34
3.3.4. IDENTIFIZIERUNG BEVORZUGT OXIDIERTER PROTEINE DURCH MASSEN
SPEKTROMETRIE 37
4. DISKUSSION
4.1. TECHNISCHE ASPEKTE DER 2D-ELEKTROPHORESE ZUR IDENTIFIZIERUNG
OXIDATIV
MODIFIZIERTER PROTEINE
39
4.1.1. PROBENVORBEREITUNG 39
4.1.2. IMMOBILISIERTE PH-GRADIENTEN VERSUS TRAEGERAMPHOLYTE 39
4.1.3. VERGLEICH MEHRERER EXPERIMENTE 40
4.1.4. MENGE DER REPRODUZIERBAREN SPOTS 41
4.2. PROTEINOXIDATION IN MITOCHONDRIEN
42
4.3. OXIDATIONSEMPFINDLICHE MITOCHONDRIALE PROTEINE: BIOCHEMIE UND
PATHOPHYSIOLOGISCHE BEDEUTUNG
44
- SPOT 1: ALDEHYDDEHYDROGENASE 2 (ALDH 2) 44
- SPOT
2/3: METHYLMALONAT-SEMIALDEHYD-DEHYDROGENASE (MMSDH) 44
- SPOT 4: H
+-TRANSPORT-ATP-SYNTHASE (ALPHA UNTEREINHEIT) 45
- SPOT 5: HYDROXYMETHYLGLUTARYL-COA SYNTHASE (HMG-COA SYNTHASE) 45
- SPOT 6: 3-HYDROXYBUTYRAT DEHYDROGENASE (BDH) 46
4.4. AUSBLICK
46
5. ZUSAMMENFASSUNG
6. LITERATURVERZEICHNIS
DANKSAGUNG
ERKLAERUNG
LEBENSLAUF
WISSENSCHAFTLICHE LEISTUNGEN |
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