Exopolysaccharide von phytopathogenen Bakterien der Gattung Erwinia:
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2003
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INHALTSVERZEICHNIS
INHALTSVERZEICHNIS
1 ZUSAMMENFASSUNG.1
2 EINLEITUNG.2
2.1 BEDEUTUNG DER PHYTOMEDIZINISCHEN FORSCHUNG.2
2.2 VERBREITUNG UND GESCHICHTE DES FEUERBRANDES.3
2.3 TAXONOMIE DER ERWINIEN UND PANTOEN.3
2.4 INFEKTION, SYMPTOME UND KRANKHEITSVERLAUF.4
2.5 VORSORGE- UND BEKAEMPFUNGSMASSNAHMEN.5
2.6 DETEKTION VON ERWINIA AMYLOVORA.5
2.7 PATHOGENITAETSFAKTOREN.6
2.8 EXOPOLYSACCHARIDE VON ERWINIA AMYLOVORA.8
3 MATERIAL.12
3.1 BAKTERIENSTAEMME.YY.12
3.2 PLASMIDE. 14
3.3 NAEHRMEDIEN UND ANTIBIOTIKA.16
3.4 CHEMIKALIEN.17
3.5 PUFFER UND LOESUNGEN.18
3.6 GERAETE.21
3.7 COMPUTERPROGRAMME.22
4 METHODEN.23
4.1 VERMEHRUNG UND LAGERUNG VON BAKTERIEN.23
4.2 SELEKTION SPONTANER BAKTERIELLER RESISTENZ.23
4.3 VIRULENZTEST VON BAKTERIEN AUF BIRNENSCHEIBEN.23
4.4 PLASMIDTRANSFER IN BAKTERIEN.23
4.4.1 ELEKTROPORATION.23
4.4.2 KONJUGATION.24
4.4.3 TRANSFORMATION (CACH-METHODE).24
4.4.3.1 HERSTELLUNG VON KOMPETENTEN ZELLEN.24
4.4.3.2 TRANSFORMATION VON KOMPETENTEN ZELLEN.24
4.5 SS-GALAKTOSIDASE-TEST.25
4.6 ELEKTROPHORESE.25
4.6.1 AGAROSE-GELELEKTROPHORESE UND DNA-FAERBUNG.25
4.6.2 SDS-POLYACRYLAMID-GELELEKTROPHORESE.25
4.7 PHOTOMETRISCHE TESTS.26
4.7.1 BESTIMMUNG DER SAUBERKEIT VON DNA-MAXIPRAEPARATIONEN.26
4.7.2 BESTIMMUNG DER DNA- KONZENTRATION.27
4.7.3 BESTIMMUNG DER GLUKOSE-KONZENTRATION (ABTS- TEST).27
4.7.4 BESTIMMUNG DER PROTEIN-KONZENTRATION (BRADFORD- TEST).27
4.7.5 BESTIMMUNG DER PROTEIN-KONZENTRATION (LOWRY-TEST). 28
4.7.6 QUANTITATIVER NACHWEIS VON AMYLOVORAN (CPC- TEST).28
4.8 PRAEPARATIONEN.28
4.8.1 MINIPRAEPARATION VON PLASMID-DNA.28
4.8.2 MAXIPRAEPARATION VON PLASMID-DNA.29
4.8.3 GEWINNUNG VON ZELLEXTRAKTEN FUER DIE EPIMERASEREAKTION.29
4.8.4 GEWINNUNG VON EXOPOLYSACCHARIDEN.30
I
BIBLIOGRAFISCHE INFORMATIONEN
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INHALTSVERZEICHNIS
4.8.4.1 GEWINNUNG VON LYOPHYLISIERTEN EXOPOLYSACCHARIDEN.30
4.8.4.2 GEWINNUNG VON NATIVEN EXOPOLYSACCHARIDEN.30
4.8.5 GEWINNUNG VON LIPOPOLYSACCHARIDEN.30
4.8.6 GEWINNUNG VON DEPOLYMERASE.31
4.9 DEPOLYMERISIERUNG VON EXOPOLYSACCHARIDEN.31
4.9.1 DEPOLYMERISIERUNG FUER STRUKTURUNTERSUCHUNGEN.31
4.9.2 DEPOLYMERISIERUNG FUER KINETIKEN.31
4.10 NACHWEIS VON UDP-ZUCKEM.31
4.10.1 UDP-GLUKOSE-NACHWEIS MIT HPLC
(.31
4.10.2 UDP-GLUKORONSAEURE-NACHWEIS MIT HPLC.32
4.10.3 UDP-GLUKOSE-NACHWEIS AUF MCCONKEY-AGAR.32
4.11 ANFAERBUNG DER LIPOPOLYSACCHARIDE.32
4.12 UDP-GALAKTOSE-4-EPIMERASEREAKTION.32
4.13 GLUKOSEOXIDASEREAKTION.33
4.14 EXOPOLYSACCHARIDSYNTHESE UNTER ANTIBIOTIKAEINWIRKUNG.33
4.15 WESTERN BLOT.33
4.16 AUFTRENNUNG VON EXOPOLYSACCHARIDEN MIT HPLC.33
4.16.1 AUFTRENNUNG VON DEPOLYMERISIERTEM EPS FUER
STRUKTURUNTERSUCHUNGEN. 33
4.16.2 AUFTRENNUNG VON EPS ZUR GROESSENANALYSE.34
4.17 UNTERSUCHUNG DER AMYLOVORANVORSTUFEN DURCH RADIOAKTIVEN EINBAU.34
4.17.1 HERSTELLUNG PERMEABLER ZELLEN.34
4.17.2 ISOLIERUNG DER RADIOAKTIVEN AMYLOVORANVORSTUFEN.34
4.17.3 ANALYSE DER RADIOAKTIVEN AMYLOVORANVORSTUFEN MIT HPLC.35
4.18 ELEKTRONENSPRAYIONISATIONS-MASSENSPEKTROMETRIE (ESI-MS).36
4.19 METHYLIERUNGSANALYSEN.36
ERGEBNISSE.37
5.1 STRUKTURUNTERSUCHUNGEN VON EXOPOLYSACCHARIDEN.37
5.1.1 ELEKTRONENSPRAY- MASSENSPEKTROSKOPIE (ESI-MS).37
5.1.1.1 QUALITATIVE UNTERSUCHUNGEN.39
5.1.1.2 QUANTITATIVE UNTERSUCHUNGEN.42
5.1.2 METHYLIERUNGSANALYSEN.43
5.2 MOLEKULARGEWICHT VON AMYLOVORAN.47
5.2.1 ANWENDUNG VON REFRAKTIV-INDEX- UND STREULICHTDETEKTOR MIT HPLC.47
5.2.1.1 VERGLEICH DER DETEKTORSENSITIVITAET.47
5.2.1.2 BEZUG VON EPS-MENGE UND DETEKTORSIGNAL.48
5.2.1.3 OPTIMIERUNG DER FLUESSIGEN PHASE FUER REFRAKTIVINDEX- UND
STREULICHTDETEKTOR.49
5.2.2 GROESSENAUSSCHLUSSCHROMATOGRAPHIE BEI EXOPOLYSACCHARIDEN.51
5.2.3 ENTWICKLUNG EINER NEUEN, SCHONENDEN PRAEPARATIONSMETHODE.51
5.2.4 EMPFINDLICHKEIT VON AMYLOVORAN BEI DER HANDHABUNG.52
5.2.5 ELUTIONSZEITENVON AMYLOVORAN VERSCHIEDENER STAEMME UND STEWARTAN.
53
5.2.6 EINFLUSS VON NAEHRMEDIUM UND INKUBATIONSZEIT.54
5.2.6.1 MOLEKULARGEWICHTE AUF FUENF UNTERSCHIEDLICHEN NAEHRMEDIEN.54
5.2.6.2 AUSWIRKUNGEN DER PHOSPHATKONZENTRATION AUF DAS MOLEKULARGEWICHT
VON AMYLOVORAN UNTERSCHIEDLICHER ERWINIENSTAEMME.55
5.2.6.3 EINFLUSS DER INKUBATIONSZEIT.56
5.3 EINFLUSS VON ANTIBIOTIKA AUF AMYLOVORANPRODUKTION UND
ZELLWACHSTUM.57
5.3.1 VERSUCHE MIT 24H INKUBATIONSZEIT.57
5.3.2 VERSUCHE MIT 48H INKUBATIONSZEIT.61
5.4 DEPOLYMERISIERUNG VON EPS.65
II
INHALTSVERZEICHNIS
5.4.1 DEPOLYMERISIERUNGSKINETIK FUER STEWARTAN.65
5.4.2 DEPOLYMERISIERUNG VON AMYLOVORAN VERSCHIEDENER STAEMME.66
5.5 KOMPLEMENTIERUNGSEXPERIMENTE AUF BIRNENSCHEIBEN.67
5.5.1 KOMPLEMENTIERUNG VON EAL/79-M34B.67
5.5.2 KOMPLEMENTIERUNG EINZELNER AMS-MUTATIONEN MIT PES2144.68
5.6 KOMPLEMENTATION VON EPL/96-MBL.70
5.6.1 KOMPLEMENTATION AUF PLATTEN.70
5.6.2 KOMPLEMENTATION IN FLUESSIGKULTUREN.71
5.6.3 KOMPLEMENTATION VON EPL/96-MB AUF BIRNENSCHEIBEN,.72
5.6.3.1 ZEITLICHER ABLAUF.72
5.6.3.2 STATISTISCHE BETRACHTUNG.73
5.6.4 KOMPLEMENTATION VON EPL/96-MB MIT DER GENBANK PCLP.73
5.7 EINFLUSS VON AMS-MUTATIONEN AUF DIE SYNTHESE VON
LIPOPOLYSACCHARIDEN.74
5.8 VERGLEICH DER LIPOPOLYSACCHARIDSTRUKTUREN VERSCHIEDENER ERWINIEN.76
5.9 UNTERSUCHUNG VON HIMBEERPATHOGENEN ERWINIEN.77
5.10 UNTERSUCHUNG DES GENS
AMSM
.77
5.10.1 EPIMERASEMESSUNG MIT DER ABTS-METHODE.78
5.10.2 KINETIK DER EPIMERASEREAKTION.7.80
5.10.3 UNTERSUCHUNG DER EPIMERASEREAKTION MIT HPLC.80
5.10.4 TESTUNG VERSCHIEDENER
AMSM
MUTANTEN AUF PLATTEN.83
5.10.5 UNTERSUCHUNG DER UDP-GLC-DEHYDROGENASE BEI
AMSM
MUTANTEN.86
5.10.6 DER EINFLUSS DES NAEHRMEDIUMS AUF DIE UDP-GLC-DEHYDROGENASE.87
5.11 EINFLUSS VON
RCSV
AUF DIE STEWARTANSYNTHESE.87
5.11.1 BESCHAFFENHEIT DES STEWARTANS BEI
RES V
-UEBEREXPRESSION.88
5.11.2 UNTERSUCHUNG DES MOLEKULARGEWICHTS BEI
RES
F-UEBEREXPRESSION.88
5.12 UNTERSUCHUNG VON AMYLOVORANVORSTUFEN.89
5.13 SEQUENZIERUNGEN VON PLASMIDEN.91
5.13.1 KONTROLLE AUF VORHANDENSEIN VON
AMSM
.91
5.13.2 KONTROLLE AUF VORHANDENSEIN VON
GALE
.94
6 DISKUSSION.96
6.1 STRUKTUR DER AINYLOVORANUNTEREINHEIT.96
6.2 MOLEKULARGEWICHT, PRODUKTION UND ABBAU VON AMYLOVORAN.99
6.3 KOMPLEMENTIERUNG EPS-NEGATIVER MUTANTEN.103
6.4 UNTERSUCHUNG DER LIPOPOLYSACCHARIDE.104
6.5 UNTERSUCHUNG DER GENPRODUKTE VON
AMS A, B, F
UND
K
.105
6.6 FUNKTION DES GENS
RCSV
.,.107
6.7 FUNKTION DES GENS
AMSM
.108
6.8 AUSBLICK.110
7 LITERATUR.112
8 ANHANG.123
8.1 ABKUERZUNGSVERZEICHNIS.123
8.2 PLASMIDKARTEN.125
8.3 GENOMKARTE.128
9 PRAESENTATIONEN.129
9.1 VORTRAEGE.129
9.2 POSTER.130
III
INHALTSVERZEICHNIS
9.3 VEROEFFENTLICHUNGEN
130
IV |
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