Untersuchung gentherapeutischer Strategien zur Prävention humaner Rezidivstenosen:
Gespeichert in:
| 1. Verfasser: | |
|---|---|
| Format: | Buch |
| Sprache: | German |
| Veröffentlicht: |
Tübingen
[Selbstverl.]
2002
|
| Schlagworte: | |
| Online-Zugang: | Inhaltsverzeichnis |
| Beschreibung: | Zugl.: Tübingen, Univ., Diss., 2002 |
| Beschreibung: | 169 S. Ill., graph. Darst. : 21 cm |
Internformat
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INHALTSVERZEICHNIS
SEITE
1.
EINLEITUNG
.
1
2.
FRAGESTELLUNG
.
11
3.
ERGEBNIS
.
13
I.
IDENTIFIZIERUNG
VON
GAX-REGULIERTEN
GENEN
.
13
3.1.
NACHWEIS
DES
GAX-PROTEINS
IM
WESTERN
BLOT
.
14
3.1.1
RADIOAKTIVER
NACHWEIS
DES
GAX-PROTEINS
.
14
3.1.2
HERSTELLUNG
VON
IMMUNSEREN
GEGEN
GAX
.
15
3.1.3
WESTERN
BLOT
UNTERSUCHUNG
ZUM
AUSTESTEN
DER
SEREN
GEGEN
GAX.
16
3
13
1
WESTERN
BLOT
ANALYSE
DER
ANTI-GAX
SEREN
16
3
13
2
AUSTESTEN
DER
PRAE-IMMUNSEREN
IM
WESTERN
BLOT
16
3
13
3
AUSTESTEN
DER
ANTI-GAX
SEREN
IM
WESTERN
BLOT
.
.
17
3.2.
KULTIVIERUNG
VON
HUMANEN
GLATTEN
MUSKELZELLEN
AUS
KORONARARTERIEN
(HCASMC)
.
18
3.2.1
IDENTIFIZIERUNG
VON
HUMANEN
GLATTEN
MUSKELZELLEN
(HCASMC)
.
18
3.2.2
KULTIVIERUNG
VON
HUMANE
GLATTEN
MUSKELZELLEN
AUS
DEN
KORONARARTERIEN
(HCASMC)
IN
VERSCHIEDENEN
MEDIEN
.
20
3
2
2
1
AUSTESTEN
VON
VERSCHIEDENEN
MEDIEN
20
3.3.
NACHWEIS
DES
GAX-PROTEINS
IN
SERUM-ARRETIERTEN
GLATTEN
MUSKELZELLEN
.
22
3.3.1
ZELLZYKLUSANALYSE
MIT
HILFE
DES
DURCHFLUSSZYTOMETER
.
23
3
3
11
BESTIMMUNG
DER
ZELLZYKLUSPHASEN
MIT
EINER
EINFACHFAERBUNG
23
3
3
12
DOPPELFAERBUNG
MIT
BROMDESOXYURIDIN
UND
EINER
MTERKALIERENDEN
SUBSTANZ
.
.23
3.3
2
NACHWEIS
DES
ZELLZYKLUSARRESTS
IN
HUMANEN
GLATTEN
MUSKELZELLEN
NACH
3
TAGEN
SERUMENTZUG
.
23
3.4.
VERAENDERUNG
DES
PROTOKOLLS
ZUR
ENDOGENEN
EXPRESSION
DES
HUMANEN
GAX
PROTEINS
.
25
3.4.1
KULTIVIERUNG
VON
HCASMC
AUF
BESCHICHTETEN
ZELLKULTURMATERIALIEN.
25
3.4.2
VERLAENGERUNG
DES
ZEITRAUMS
DES
SERUMENTZUGS
.
27
3.4.3
HUMANE
GLATTE
MUSKELZELLEN
WURDEN
MIT
UNTERSCHIEDLICHEN
ANTEILEN
AN
FKS
KULTIVIERT
.
28
3.4
4
KULTIVIERUNG
VON
HUMANEN
GLATTEN
MUSKELZELLEN
IN
MEDIEN
MIT
UNTERSCHIEDLICHEN
SERUM-CHARGEN
.
28
3.4
5
ARRETIERUNG
DER
HCASMC
MIT
0
%
SERUMANTEIL
.
29
3.4.6
HUMANE
GLATTE
MUSKELZELLEN
VON
VERSCHIEDENEN
SPENDERN
.
29
3.4.7
HUMANE
GLATTE
MUSKELZELLEN
AUS
ANDEREN
GEWEBEN
.
29
3.4.8
GLATTE
MUSKELZELLEN
AUS
EINER
RATTENAORTA
.
30
3.4.9
AENDERUNGEN
AN
DER
NACHWEISMETHODE
VON
GAX
IM
WESTERN
BLOT
.
32
3.5.
EXOGENE
GAX
EXPRESSION
IN
HUMANEN
GLATTEN
MUSKELZELLEN
.
32
3.5.1
TRANSFEKTION
.
32
3
5
1.1
TRANSFEKTION
MIT
HILFE
VON
VERSCHIEDENEN
KATIONISCHEN
LIPOSOMEN
33
3
5
12
TRANSFEKTION
MIT
REAGENZIEN,
DIE
SPEZIELL
FUER
PNMAERZELLEN
ENTWICKELT
WURDEN
.
33
3.6.
REKOMBINANTE
ADENOVIREN
.
34
3
6.1
HERSTELLUNG
VON
REKOMBINANTEN
ADENOVIREN
.
35
3
6
11
HOMOLOGE
REKOMBINATION
ZUR
GENERIERUNG
VON
AD
TRACK
ADENOVIREN
36
3
6
12
TRANSFEKTION
DER
REKOMBINANTEN
ADENOVIRUSPLASMIDE
IN
10
SW
HELFERZELLEN
36
3
6.2
BESTIMMUNG
DER
INFEKTIONSRATE
MIT
HILFE
DES
DURCHFLUSSZYTOMETERS.
37
3.6.3.
INFEKTION
VON
HUMANEN
GLATTEN
MUSKELZELLEN
MIT
DEM
REKOMBINANTEN
ADENOVIRUS
AD
TRACK
.
38
3.6.4
HERSTELLUNG
DER
REKOMBINANTEN
ADENOVIREN
AD
GAXHA
UND
AD
SHUTTLE
.
39
3
6 4
1
KLONIERUNG
VON
GAXHA
IN
DEN
TRANSFERVEKTOR
PSHUTTLE-CMV
.
39
3
6
4
2
HOMOLOGE
REKOMBINATION
39
3.6.5
INFEKTION
VON
HUMANEN
GLATTEN
MUSKELZELLEN
MIT
AD
GAXHA
.
40
3.7
DIFFERENTIELLE
RT
PCR
.
41
3.7
1
DIFFERENTIELLE
RT
PCR
NACH
INFEKTION
MIT
EINER
MOI
VON
100
AD
GAXHA
.
42
3.7.2.
INFEKTION
VON
HUMANEN
GLATTEN
MUSKELZELLEN
MIT
UNTERSCHIEDLICH
HOHER
VIRUSKONZENTRATION
FUER
DREI
VERSCHIEDENEN
ZEITPUNKTE
.
43
3.7.3
NACHWEIS
VON
GAXHA
IM
WESTERN
BLOT
NACH
INFEKTION
VON
HCASMC
MIT
AD
GAXHA.
44
3.7.4
MORPHOLOGIE
DER
HUMANEN
GLATTEN
MUSKELZELLEN
NACH
ADENOVIRALER
INFEKTION
MIT
EINER
MOI
VON
1000
.
47
3.7.5
DIFFERENTIELLE
RT
PCR
NACH
INFEKTION
HUMANER
GLATTER
MUSKELZELLEN
MIT
EINER
MOI
VON
1000
AD
GAXHA
.
48
3.8.
REKOMBINANTE
BACULOVIREN
.
49
3
8
1
KLONIERUNG
VON
CMVGAXHA
IN
DEN
BACULO-TRANSFERVEKTOR
BLUEBAC4.5
.
50
3.8.2
KLONIERUNG
DES
CMV-PROMOTORS
IN
DEN
BACULO-TRANSFERVEKTOR
BLUEBAC4.5
.
51
3.8.3
TRANSFEKTION
UND
HOMOLOGE
REKOMBINATION
IN
INSEKTENZELLEN
.
52
3.8.4
PLAQUE-ASSAY
ZUR
ISOLIERUNG
VON
REKOMBINANTEN
BACULOVIREN
.
52
3
8
4
1
PCR-ANALYSE
.
53
3
8
4
2
UEBERPRUEFUNG
DER
GAX
CDNA-ENTHALTENDEN
VIREN
.
.
54
3
8
4
3
PCR-ANALYSE
DES
REKOMBINANTEN
BACULOVIRUS
BV
CMV
55
3.8.5
HIGH-TITER-STOCK
UND
AUFREINIGUNG
DER
BACULOVIREN
.
56
3.8.6.
INFEKTION
VON
HUMANEN
GLATTEN
MUSKELZELLEN
MIT
BV
CMV
GAXHA.
56
3.8.7
MORPHOLOGISCHE
UNTERSUCHUNG
DER
MIT
BV
CMVGAXHA
INFIZIERTEN
HUMANEN
GLATTEN
MUSKELZELLEN
.
58
II.
APPLIKATION
VON
THERAPEUTISCHEN
GENEN
IN
DER
GENTHERAPIE
.
59
3.9.
VERGLEICH
DER
INFEKTIONSRATEN
REKOMBINANTER
BACULOVIREN
UND
REKOMBINANTER
ADENOVIREN
.
59
3.9.1
DAUER
DER
VIRUSINKUBATION
.
60
3
9
11
VIRUSINKUBATION
FUER
2
H.
60
3
9.1
2
VIRUSINKUBATION
FUER
5
H
62
3
9
13
VERGLEICH
DER
INFEKTIONSRATEN
VON
AD
TRACK
NACH
2
H
BZW
5
H
VIRUSINKUBATION
64
3
9
14
VERGLEICH
DER
INFEKTIONSRATEN
VON
BV
EGFP
NACH
2
H
BZW
5
H
VIRUSINKUBATION
65
3.10.
VERGLEICH
DER
WERTE
FUER
DEN
MEDIAN
DER
FLUORESZENZ
DER
REGION
M2
NACH
INFEKTION
MIT
REKOMBINANTEN
BACULOVIREN
UND
REKOMBINANTEN
ADENOVIREN
.
65
3.10.1
DAUER
DER
VIRUSINKUBATION
.
66
3.10.1
1
VIRUSINKUBATION
FUER
2
H
.
66
3
10
1
2
VIRUSINKUBATION
FUER
5
H
.
.
68
310
13
VERGLEICH
DER
WERTE
FUER
DEN
MEDIAN
DER
FLUORESZENZ
DER
REGION
M2
NACH
2
H
BZW
5
H
VIRUSINKUBATION
MIT
AD
TRACK
.
70
3
10
1.4
VERGLEICH
DER
WERTE
FUER
DEN
MEDIAN
DER
FLUORESZENZ
DER
REGION
M2
NACH
2
H
BZW
5
H
VIRUSINKUBATION
MIT
BV
EGFP
.
70
3.11
VERGLEICH
DER
INFEKTIONSRATEN
VON
BV
EGFP
MIT
UND
OHNE
NATRIUMBUTYRAT
IM
MEDIUM
.
71
3.12.
VERGLEICH
DER
WERTE
FUER
DEN
MEDIAN
DER
FLUORESZENZ
DER
REGION
M2
NACH
INFEKTION
VON
BV
EGFP
MIT
UND
OHNE
NATRIUMBUTYRAT
.
73
4.
DISKUSSION
.
75
4.I.
IDENTIFIZIERUNG
VON
GAX-REGULIERTEN
GENEN
.
75
4
11.
ENDOGENE
GAX-EXPRESSION
.
75
4.I.2.
EXOGENE
GAX-EXPRESSION
.
80
4.
II.
APPLIKATION
VON
THERAPEUTISCHEN
GENEN
.
83
4.11.1.
VERGLEICH
DER
INFEKTIONSRATEN
.
85
4.II.2.
VERGLEICH
DER
WERTE
FUER
DEN
MEDIAN
DER
FLUORESZENZ
.
88
4.
II.
3.
BEHANDLUNG
DER
ZELLEN
MIT
NATRIUMBUTYRAT
.
93
4.II.4.
SCHLUSSFOLGERUNG
.
94
5.
ZUSAMMENFASSUNG
.
97
6.
MATERIAL
.
99
6.1.
ZELLEN.
99
6.1.2
MEDIEN
/
LOESUNGEN
FUER
DIE
ZELLKULTUR
.
101
6.2.
BAKTERIEN,
PLASMIDE
UND
VEKTOREN
.
102
6.2.1
E.COLI
STAEMME
.
102
6.2.2
VEKTOREN
UND
PLASMIDE
.
102
6
2
2
1
PLASMIDE
DES
BACULOVIRUS-SYSTEM
.
.
.
102
6
2
2
2
BACULOVIREN
.
102
6.2.2
3
PLASMIDE
DES
ADENOVIRUS
SYSTEMS
.
.
.
.
.
102
6.2.3.
BAKTERIENMEDIEN
/
PLATTEN
.
102
6.3.
DNA
TECHNIKEN
.
103
6
3.1
PUFFER
FUER
ANALYTISCHE
UND
PRAEPARATIVE
GELELEKTROPHORESE
.
103
6.3.2
DNA-LAENGENSTANDARD
.
104
6.3.3
ENZYME.
104
6.3.4
ISOLIERUNG
VON
DNA-FRAGMENTEN
AUS
DEM
GEL
.
104
6
3
4
1
QIAQUICK
GEL
EXTRACTION
KIT
(QIAGEN)
.
104
6.3
4
2
JET
SORB
KIT
.
105
6.3.5
PLASMIDISOLIERUNG
IM
ANALYTISCHEN
MASSSTAB
(MINI
PRAEP)
.
105
6.3.6
PLASMIDISOLIERUNG
IM
PRAEPARATIVEN
MASSSTAB
NACH
QIAGEN
.
105
6.3
7
PLASMIDISOLIERUNG
IM
PRAEPARATIVEN
MASSSTAB
MIT
HILFE
DES
CSCI
GRADIENTEN
.
105
6.3.8
SEQUENZIERUNG.
105
6.3.9
PRIMER
.
106
6.4
PROTEINE
.
107
6.4.1
TNT
LYSATE
COUPLED
TRANSCRIPTION/TRANSLATION
KIT
.
107
6.4.2
LOESUNGEN
FUER
SDS-PAGE
.
107
6.4.3
PROTEINMARKER
.
108
6.4.4
FRIER
TAU
PUFFER
FUER
PROTEINEXTRAKTE.
108
6.4.5
WESTERN
BLOT
PUFFERLOESUNGEN
.
108
6
4
51
NASS-BLOT .
.
108
6 4
5.2
SEMI-DRY
BLOT
.
.
.
108
6.4
6
PROTEINGEL-FAERBELOESUNG
.
109
6.4.7
DETEKTION
DER
PROTEINE
IM
WESTERN
BLOT
.
109
6.4.8
ANTIKOERPER
IM
WESTERN
BLOT
.
109
64
8
1
PRIMAER-ANTIKOERPER
109
6
4
8
2
SEKUNDAER-ANTIKOERPER.
.
109
6.5
ARBEITEN
MIT
RNA
.
110
6.5
1
ISOLIERUNG
VON
GESAMT-RNA
.
110
6.5.2
ISOLIERUNG
VON
MRNA
AUS
GESAMT-RNA
.
110
6.5.3
REVERSE
TRANSKRIPTIONS-REAKTION
.
110
6.5.4
PRIMER
FUER
DIE
DIFFERENTIELLE
PCR
.
111
6.6
T
RANSFEKTION
.
111
6.6.1
TRANSFEKTION
NACH
CHEN
UND
OKAYAMA
.
111
6.6.2
TRANSFECTION
REAGENT
SAMPLE
KIT
(QIAGEN)
.
112
6.6.3
X-GAL-FAERBUNG
(LAC
Z-ASSAY)
.
112
6.6.3
1
FIXIERLOESUNG
.
112
6.6.3.2
FAERBELOESUNG
.
112
6.7.
DURCHFLUSSZYTOMETRISCHE
ANALYSEN
(FACS)
.
112
6.7.1
ZELLZYKLUSANALYSE
.
112
6
7
1
1
EINFACHFAERBUNG
.
.
112
6
71
2
DOPPELFAERBUNG,
.
.
112
6.7
1
3
INTERKALIERENDE
SUBSTANZEN
/
FLUORESZENZ
MARKIERTE
ANTIKOERPER
.
113
6.8.
REKOMBINANTE
VIREN
.
113
6.8.1
REKOMBINANTE
BACULOVIREN
.
113
6
8.1
1
BAC-N-BLUEYYTRANSFECTION
KIT
(INVITROGEN)
113
6.81
2
PLAQUE
ASSAY
.
.
113
6.8
1
3
SACCHAROSELOESUNGEN
ZUR
AUFREINIGUNG
DER
BACULOVIREN.
.113
6.8.2
REKOMBINANTE
ADENOVIREN
.
113
6.8.2
1
ADENOVIRUS
AUFBEWAHRUNGSPUFFER
TSG
PUFFER
,113
6.9.
CHEMIKALIEN
(BEZUGSQUELLEN)
.
114
6.10.
KITS
(BEZUGSQUELLEN)
.
114
6.11.
GERAETE
UND
SONSTIGE
MATERIALIEN
.
114
7.
METHODE
.
115
7.1.
ZELLKULTUR
.
115
7.1.1
AUFTAUEN
VON
ZELLEN
.
115
7.1.2
EINFRIEREN
VON
ZELLEN
.
115
7.1.3
KULTIVIERUNG
VON
ZELLEN
AM
BEISPIEL
VON
HCASMC
ZELLEN
.
116
7.1.4
NACHWEIS
VON
MYCOPLASMEN
IN
ZELLKULTUREN
MIT
DEM
FLUORESZENZFARBSTOFF
DAPI
(ROCHE)
.
117
7
1
4
1
ANFAERBEN
VON
ADHAERENTEN
ZELLKULTUREN
. .
117
7.2.
DNA
TECHNIKEN
.
117
7.2.1
GELELEKTROPHORESE
.
117
72
12
AGAROSEGELE
.
117
72
12
POLYACRYLAMID
GELE
(PAA-GELE)
,118
7.2.2
PHENOLEXTRAKTION
UND
ETHANOLPRAEZIPITATION
VON
DNA
.
118
7.2.3
RESTRIKTIONSVERDAU
.
119
7.2.4
ISOLIERUNG
VON
DNA-FRAGMENTEN
AUS
AGAROSEGELEN
.
120
7
2
4.1
QIAQUICK
(QIAGEN)
120
7
2
4
2
JET
SORB
.
120
7.2.5
KLONIERUNG
VON
DNA
FRAGMENTEN
.
121
7
2
5
1
PHOSPHORYLIERUNG
VON
DNA
FRAGMENTEN
.
.121
7
2
5
2
DEPHOSPHORYLIERUNG
VON
VEKTOREN
.
121
7
2
5
3
LIGATION
121
7.2
5
4
HERSTELLUNG
VON
ELEKTROKOMPETENTEN
BAKTERIEN
122
7 2
5
5
ELEKTROTRANSFORMATION
.
122
7 2
5
6
PLASMID
PRAEPARATION
IM
ANALYTISCHEN
MASSSTAB
(MIM
PRAEP
).
123
7
2
5
7
PLASMIDISOLIERUNG
IM
PRAEPARATIVEN
MASSSTAB
(MAXI
PRAEP
)
123
7.2
6
SEQUENZIERUNGSREAKTION
.
125
7.3.
RNA
TECHNIKEN
.
126
7.3.1
ISOLIERUNG
VON
GESAMT-RNA
NACH
CHOMCZYNSKI
UND
SACCHI
(1987)
.
126
7.3.2.
ISOLIERUNG
VON
MRNA
MIT
HILFE
DES
MRNA
PURIFICATION
KIT.
127
7.3.3
DIFFERENTIELLE
RT-PCR
.
128
7
33
1
DIE
REVERSE
TRANSKRIPTION
(RT-REAKTION)
128
7
3
3
2
SS-ACTIN
PCR
ZUR
UEBERPRUEFUNG
DER
RT-REAKTION
129
7
3
3
3
DIFFERENTIELLE
PCR
.129
7.4.
PROTEINE
.
130
7.4.1
HERSTELLUNG
VON
PROTEINEXTRAKTEN
.
130
7.4.2
SDS-POLYACRYLAMID
GELELEKTROPHORESE
(SDS-PAGE)
.
131
7.4.3
WESTERN
BLOT:
TRANSFER
VON
PROTEINEN
AUF
EINE
MEMBRAN
.
131
74
3
1
NASSBLOT
131
7
4
3
2
SEMI-DRY
BLOT
131
7.4.4
DETEKTION
DES
WESTERN
BLOTS
.
132
7
4
5
HERSTELLUNG
EINES
GAX-PROTEINS
MIT
HILFE
DES
IN
VITRO
T
RANSKRIPTIONS/T
RANSLATIONSANSATZES
.
133
7.5.
TRANSFEKTION
.
133
7.5
1
UEBERPRUEFUNG
DER
TRANSFEREFFIZIENZ
LAC
Z
ASSAY
(X-GAL
FAERBUNG)
.
133
7.5.2
TRANSFEKTION
MIT
HILFE
VON
KATIONISCHEN
LIPOSOMEN
.
134
7.5.3
TRANSFEKTION
MIT
SUPERFECT
(QIAGEN)
.
134
7.5.4
TRANSFEKTION
MIT
CYTOFEKTIN
GS
.
135
7.5.5
TRANSFEKTION
MIT
CA-PHOSPHAT
.
135
7.6.
DURCHFLUSSZYTOMETRISCHE
ANALYSEN
MIT
HILFE
DES
FACS
.
136
7.6.1
ZELLZYKLUSANALYSE
MIT
HILFE
DES
DURCHFLUSSZYTOMETERS
.
136
7
6
1
1
EINFACHFAERBUNG
.
136
7
6
12
DOPPELFAERBUNG
MIT
BROMDESOXYURIDIN
UND
EINER
INTERKAHERENDEN
SUBSTANZ
.
.
136
7.7.
HERSTELLUNG
VON
REKOMBINANTEN
VIREN
.
137
7
7.1
REKOMBINANTE
BACULOVIREN
.
137
7.71.1
TRANSFEKTION
.
.
137
7
7
12
PLAQUE
ASSAY
.
138
7
7
13
PCR
ANALYSE
DER
REKOMBINANTEN
VIREN
138
I
ISOLIERUNG
DER
VIRALEN
DNA
.
139
II
BACULOVIRUS-PCR
.
139
7.7
1
4
HERSTELLUNG
EINES
HIGH-TITER-STOCKS
.
140
7
7
15
AUFREINIGUNG
DER
VIREN
141
7
7
16
BESTIMMUNG
DES
TITERS
DER
AUFGEREINIGTEN
VIREN
.
.142
7.7.2
HERSTELLUNG
VON
REKOMBINANTEN
ADENOVIREN
.
142
7
7
2
1
HOMOLOGE
REKOMBINATION
IN
BAKTERIEN
142
7
7.2.2
TRANSFEKTION
DER
REKOMBINANTEN
ADENOVIRUSPLASMIDE
IN
DIE
HELFERZELLIME
144
7.7
2
3
ADENOVIRUS-AUFREIMGUNG
UEBER
EINEN
CSCI
GRADIENTEN
.
145
7
7
2
4
BESTIMMUNG
DES
TCIDSO
WERTES.
145
7.8
VERGLEICH
DER
INFEKTIONSRATEN
VON
REKOMBINANTEN
BACULOVIREN
UND
REKOMBINANTEN
ADENOVIREN
.
146
8.
LITERATUR
.
147
9.
ABKUERZUNGEN
.
158
10.
BILDTAFELN
.
160 |
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