Struktur, Funktion und spektroskopische Eigenschaften der flavinbindenden Domänen des pflanzlichen Blaulichtrezeptors Phototropin (phot1):
Gespeichert in:
| 1. Verfasser: | |
|---|---|
| Format: | Buch |
| Sprache: | German |
| Veröffentlicht: |
2002
|
| Schlagworte: | |
| Online-Zugang: | Inhaltsverzeichnis |
| Beschreibung: | München, Univ., Fak. für Biologie, Diss., 2002 |
| Beschreibung: | IV, 229 S. Ill., graph. Darst. : 21 cm |
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INHALTSVERZEICHNIS
1
EINLEITUNG
.
1
1.1
D
IE
VERSCHIEDENEN
P
HOTOREZEPTORSYSTEME
.
2
1.1.1
D
AS
P
HYTOCHROMSYSTEM
.
2
1.1.2
D
IE
C
RYPTOCHROME
.
3
1.1.3
A
NDERE
UV-/B
LAULICHT
-R
EZEPTOREN
.
4
1.2
D
ER
P
HOTOTROPISMUS
.
4
1.2.1
D
IE
G
ESCHICHTE
DES
P
HOTOTROPISMUS
.
5
1.2.1.1
DIE
ENTDECKUNG
UND
ERSTE
STUDIEN
.
5
1.2.1.2
DOSIS-EFFEKT-BEZIEHUNGEN
UND
DIE
FRAGE
NACH
DER
ANZAHL
DER
VERANTWORTLICHEN
PHOTOREZEPTOREN
.
6
1.2.1.3
DIE
NATUR
DES
CHROMOPHORS
.
8
1.2.1.4
DIE
PHOTOTROPISCHE WACHSTUMSKRUEMMUNG
-
BLAULICHTINDUZIERTE
DIFFERENTIELLE
HEMMUNG
ODER
ZUNAHME
DES
WACHSTUMS
?
.
10
1.2.2
D
IE
BIOCHEMISCHE
C
HARAKTERISIERUNG
DER
BLAULICHTVERMITTELTEN
P
ROTEINPHOSPHORYLIERUNG
.
12
1.2.2.1
VORKOMMEN
UND
LOKALISIERUNG
.
13
1.2.2.2
DIE
EIGENSCHAFTEN
DER
PHOSPHORYLIERUNGSREAKTION
UND
MOEGLICHE
GRUENDE
FUER
EINE
AUTOPHOSPHORYLIERUNG
.
14
1.2.2.3
DIE
PHOSPHORYLIERUNGSSTELLEN
.
16
1.2.2.4
DIE
WIEDERHERSTELLUNG
DER
PHOSPHORYLIERBARKEIT
IM
DUNKELN
.
16
1.2.2.5
ERINNERUNGSEFFEKT
.
17
1.2.2.6
DIE
BLAULICHTVERMITTELTE
MOBILITAETSREDUKTION
.
18
1.2.3
G
ENETISCHE
UND
MOLEKULARBIOLOGISCHE
C
HARAKTERISIERUNG
DES
P
HOTOTROPISMUS
.
18
1.2.3.1
MUTANTENSTUDIEN
.
18
1.2.3.2
KORRELATION
ZWISCHEN
MUTANTENSTUDIEN
UND
BLAULICHTVERMITTELTER
PROTEINPHOSPHORYLIERUNG
.
19
1.2.3.3
DIE
KLONIERUNG
UND
CHARAKTERISIERUNG
DES
NPHI-GENS
.
20
1.2.3.4
SIGNAITRANSDUKTION
.
21
1.2.4
N
OMENKLATUR
.
22
1.3
A
UFGABESTELLUNG
DIESER
A
RBEIT
.
22
2
MATERIAL
.
23
2.1
O
RGANISMEN
.
23
2.1.1
P
FLANZENMATERIAL
.
23
2.1.2
B
AKTERIENSTAEMME
.23
2.2
P
LASMIDE
,
E
XPRESSIONSSYSTEM
UND
O
LIGONUKLEOTIDE
.
24
2.2.1
P
LASMIDE
UND
HETEROLOGES
E
XPRESSIONSSYSTEM
.
24
2.2.2
S
YNTHETISCHE
O
LIGONUKLEOTIDE
.
24
2.2.2.1
SYNTHETISCHE
OLIGONUKLEOTIDE
FUER
KLONIERUNG
.
24
2.2.2.2
SYNTHETISCHE
OLIGONUKLEOTIDE
FUER
ZIELGERICHTETE
MUTAGENESE
.
25
2.3
A
NTIKOERPER
,
A
FFINITAETSMATRICES
UND
C
HROMOPHORE
.
26
2.4
V
ERBRAUCHSMATERIAL
.
27
2.4.1
C
HEMIKALIEN
.
27
2.4.2
R
EAGENZIEN
.28
2.4.3
R
ADIONUKLEOTIDE
.
28
2.4.4
E
NZYME
.
28
2.4.4.1
RESTRIKTIONSENZYME
.
28
2.4.4.2
POLYMERASEN
.
29
2.4.4.3
RNASE
.
29
2.4.4.4
ENDOPROTEASEN
.29
INHALTSVERZEICHNIS
2.4.4.5
PROTEASE-INHIBITOREN
.29
2.4.4.6
KINASEN
.
29
2.4.47
SONSTIGE
ENZYME
.
29
2.4.5
G
ROEBENSTANDARDS
.
30
2.4.6
G
ERAETE
UND
SONSTIGES
V
ERBRAUCHSMATERIAL
.
32
3
METHODEN
.
34
3.1
A
NZUCHTDES
P
FLANZENMATERIALS
.
34
3.2
B
IOCHEMISCHE
A
RBEITSMETHODEN
.
34
3.2.1
H
ERSTELLUNG
VON
R
OHEXTRAKTEN
.
34
3.2.2
IMMUNOPRAEZIPITATION
.
35
3.2.3
I
SOLIERUNG
VON
R
OHMEMBRANEN
(
MIKROSOMALE
M
EMBRANEN
)
.
36
3.2.4
G
EWINNUNG
VON
LOESLICHEM
P
HOTOTROPIN
DURCH
P
ROTEINABLOESUNG
VON
MIKROSOMALEN
MEMBRANEN
.
37
3.2.4.1
MIT
DETERGENTIEN
.
37
3.2.4.2
MIT
HOHEN
SALZKONZENTRATIONEN
ODER
CHAOTROPEN
REAGENZIEN
.
38
3.2.4.3
MIT
DETERGENS
UND
SALZEN
.
38
3.2.4.4 MIT
SALZEN
UND
DETERGENS
.
38
3.2.5
G
ROEBENFILTRATION
.
38
3.2.6
P
ROTEINPHOSPHORYLIERUNG
UND
Y
-^P-M
ARKIERUNG
.
39
3.2.6.1
PHOSPHORYLIERUNG
VON
ZELLROHEXTRAKTEN
.
39
3.2.6.2 PHOSPHORYLIERUNG
VON
MIKROSOMALEN
MEMBRANEN
.
40
3.2.6.3
PHOSPHORYLIERUNG
VON
UEBEREXPRIMIERTEN
PROTEINEN
.
40
3.2.7
G
ELELEKTROPHORESE
.
40
3.2.7.1
DENATURIERENDE GELELEKTROPHORESE:
NATRIUM-DODECYLSULFAT-POLYACRYLAMID
GELELEKTROPHORESE
(SDS-PAGE)
IM
KONTINUIERLICHEN
TRIS-GLYDN
PUFFERSYSTEM
.
40
3.27.2
DODECYLMALTOSID-GELELEKTROPHORESE
IN
ANLEHNUNG
AN
BN-PAGE
IM
DISKONTINUIERLICHEN
PUFFERSYSTEM
.
41
3.2.8
F
AERBEMETHODEN
FUER
P
ROTEINE
.42
3.2.8.1
COOMASSIEFAERBUNG
.
42
3.2.8.2
SILBERFAERBUNG
.42
3.2.8.3
PONCEAUFAERBUNG
.42
3.2.9
W
ESTERNBLOT
UND
I
MMUNOLOGISCHER
N
ACHWEIS
.43
3.2.10
A
MMONIUMSULFAT
-F
AELLUNG
.43
3.2.11
P
ROTEINMENGENBESTIMMUNG
.
44
3.2.12
B
ESTIMMUNG
DES
P
ROTEIN
-C
HROMOPHOR
-V
ERHAELTNISSES
.
44
3.2.13
T
HROMBINVERDAU
ZUR
A
BSPALTUNG
DES
CBP-F
USIONSPROTEINS
.44
3.2.14
G
ELELUTION
.
45
3.2.15
T
RYPSINSPALTUNG
.45
3.2.16 C
YANBROMID
-S
PALTUNG
.
46
3.2.17
C
HROMATOGRAPHIE
.46
3.2.17.1
DUENNSCHICHT-ELEKTROPHORESE
.46
3.2.17.2
AUFSTEIGENDE
DUENNSCHICHTCHROMATOGRAPHIE
.
46
3.2.18
A
FFINITAETSREINIGUNG
MIT
DEM
R
EAKTIVFARBSTOFF
C
IBACHCHRON
B
LAU
.
47
3.2.19
N
ACHWEIS
FUER
N-A
CETYLGLUCOSAMINIERUNG
.48
3.2.20
G
LYCOPROTEINNACHWEIS
.
48
3.2.21
M
ASSENSPEKTROSKOPIE
.49
3.3
M
OLEKULARBIOLOGISCHE
A
RBEITSMETHODEN
.49
3.3.1
S
TANDARDARBEITSTECHNIKEN
.
49
3.3.1.1
HERSTELLUNG
KOMPETENTER
E.
CO/F-ZELLEN
.
49
3.3.1.2
TRANSFORMATION
IN
BAKTERIEN
.
50
3.3.1.3
PLASMIDPRAEPARATION
.
50
3.3.1.3.1
MINIPRAEPARATION
PER
YYSPIN
COLUMNS
"
.
50
II
INHALTSVERZEICHNIS
3.3.1.3.2
STANDARD-MINIPRAEPARATION
.
51
3.3.1.3.3
MIDIPRAEPARATION
.
51
3.3.1.4 BESTIMMUNG
DER
KONZENTRATION
UND
REINHEIT
VON
DNS
.
51
3.3.1.5 POLYMERASE-KETTENREAKTION
(PCR)
.
52
3.3.1.6
RESTRIKTIONSVERDAU
.
52
3.3.1.7
ELEKTROPHORESE
.
53
3.3.2
K
LONIERUNG
IN
E.
COLI
.
53
3.3.2.1
PCR
ZUR
AMPLIFIKATION
EINES
DNS-FRAGMENTS
.
53
3.3.2.2
RESTRIKTIONSVERDAU
UND
VEKTORDEPHOSPHORYLIERUNG
.
54
3.3.2.3
LIGATION
.
54
3.3.2.4
TRANSFORMATION
.
54
3.3.2.5
UEBERPRUEFUNG
DER
KLONIERUNG
.
55
3.3.2.6
GLYCERINKULTUR
.
55
3.3.3
Z
IELGERICHTETE
M
UTAGENESE
.
55
3.3.3.1
MUTATIONS-PCR
.
55
3.3.3.2
DPNL-VERDAU
.
56
3.3.3.3
TRANSFORMATION
.
56
3.3.3.4
MUTATIONSUEBERPRUEFUNG
.
57
3.3.3.4.1
MITTELS
RESTRIKTIONSVERDAU
.
57
3.3.3.4.2 BIOCHEMISCHE
EIGENSCHAFTEN
BEI
PROTEINEXPRESSION
.
57
3.3.4 H
ETEROLOGE
E
XPRESSION
IN
E.
COLI
.
57
3.3.5
ZELLAUFSCHLUSS
.
58
3.3.5.1
STANDARDMETHODE
.
58
3.3.5.2
MINIEXPRESSIONSANALYSE
.
58
3.3.S.3
LOESLICHKEITSANALYSE
.
58
3.3.6
A
FFINITAETSREINIGUNG
DER
F
USIONSPROTEINE
.
59
3.3.6.1
PMAL-KONSTRUKTE
.
59
3.3.6.2
PCAL-KONSTRUKTE
.
59
4
ERGEBNISSE
.
61
4.1
I
MMUNOLOGISCHER
N
ACHWEIS
VON
P
HOTOTROPIN
DURCH
K
REUZREAKTION
MIT
A
NTI
-
NPH1
.
61
4.2
L
OKALISATION
VON
P
HOTOTROPIN
AUS
P
FLANZEN
UND
V
ERSUCHE
ZU
SEINER
A
NREICHERUNG
.
70
4.2.1
G
EWEBESPEZIFITAET
UND
V
ERTEILUNG
ENTLANG
DER
K
OLEOPTILE
.
70
4.2.2
D
IE
P
HOTOTROPINMENGE
IN
P
FLANZEN
IM
ETIOLIERTEN
UND
VORBELICHTETEN
Z
USTAND
.
75
4.2.3
I
NTRAZELLULAERE
L
OKALISATION
,
DIE
D
ISSOZIATION
VON
P
HOTOTROPIN
VON
DER
P
LASMAMEMBRAN
IM
L
ICHT
UND
E
VIDENZEN
FUER
EINEN
HOEHERMOLEKULAREN
P
HOTOTROPINKOMPLEX
IM
D
UNKELN
.
76
4.2.4
A
UFREINIGUNG
VON
P
HOTOTROPIN
UNTER
DEM
A
SPEKT
EINER
A
NREICHERUNG
.
82
4.2.4.1
STABILITAET
VON
PHOTOTROPIN
.
82
4.2.4.2
MEMBRANPRAEPARATION
UND
SOLUBILISIERUNG
MIT
DETERGENTIEN
UND/ODER
SALZEN
.
.
86
4.2.4.3
AFFINITAETSREINIGUNG
.
90
4.3
C
HARAKTERISIERUNG
DER
LOV2-C
HROMOPHORBINDUNG
.
94
4.3.1
V
ORARBEITEN
.
94
4.3.2
G
ENERIERUNG
VON
LOV2-P
UNKTMUTATIONEN
.
103
4.3.2.1
SEQUENZANALYSE
DER
LOV-DOMAENEN
.
103
4.3.2.2
DIE
STRUKTUR
DER
LOV-DOMAENEN
IM
MOLEKUELMODELL
.
105
4.3.2.3
ZIELGERICHTETE
IN
VITRO
MUTAGENESE
IN
LOV2
.
108
4.3.3
C
HARAKTERISIERUNG
DER
LOV2-P
UNKTMUTATIONEN
.
110
4.3.3.1
BIOCHEMISCHE
ANALYSE
DER
CBP-LOV2-MUTANTEN
.
110
4.3.3.2
SPEKTRALE
CHARAKTERISIERUNG
.
112
III
INHALTSVERZEICHNIS
4.3.3.3
SIMULATION
DER
MUTANTEN
IM
MOLEKUELMODELL
.
117
4.3.4
SCHLUUFOLGERUNGEN
ZUR
CHROMOPHORBINDUNG
IN
CBP-LOV2
.
125
4.4
D
IE
LICHTVERMITTELTE
P
HOSPHORYLIERUNGSREAKHON
UND
DIE
K
ARTIERUNG
VON
P
HOSPHORYLIERUNGSSTELLEN
.
126
4.4.1.1
ABHAENGIGKEIT
VON
DER
ATP-MENGE
.
126
4.4.1.2
DIE
WIEDERHERSTELLUNG
DER
PHOSPHORYLIERBARKEIT
IM
DUNKELN
.
128
4.4.1.2.1
DIE
DUNKELREGENERATION
.
128
4.4.1.2.2
TEST
AUF
ZUSAETZLICHE
LICHTINDUZIERTE
POSTTRANSLATIONALE
MODIFIKATIONEN
BEI
PHOTOTROPIN
.
133
4.4.2
L
ICHTINDUKTION
.
136
4.4.2.1
LICHTMENGE
.
136
4.4.2.2
LICHTQUALITAET
.
138
4.4.3
D
IE
B
ESTIMMUNG
VON
P
HOSPHORYLIERUNGSSTELLEN
IN
P
HOTOTROPIN
.
145
4.4.3.1
DIE
PHOSPHORYLIERUNG
VON
HETEROLOG
EXPRIMIERTEM
PHOTOTROPIN
.
145
4.4.3.2
HETEROLOGE
EXPRESSION
UND
PHOSPHORYLIERUNG
VON
PHOTOTROPINSUBDOMAENEN
.
.
148
4.4.3.3
GENERIERUNG
VON
PHOSPHORYLIERUNGSMUTANTEN
.
153
4.4.3.3.1
IN
DER
N-TERMINALEN
DOMAENE
.
154
4.4.3.3.2
IN
DER
H1-REGION
.
162
4.4.3.4
DIE
UEBERPRUEFUNG
DER
ERMITTELTEN
PHOSPHORYLIERUNGSSTELLEN
IN
HAFERPHOTOTROPIN
.
167
5
DISKUSSION
.
17S
6
ZUSAMMENFASSUNG
.205
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