Einfluss von Wachstumsfaktoren und inflammatorischen Mediatoren auf die autokrine Fibronektin-induzierte Migration von humanen intestinalen Myofibroblasten:
Gespeichert in:
| 1. Verfasser: | |
|---|---|
| Format: | Abschlussarbeit Buch |
| Sprache: | German |
| Veröffentlicht: |
2002
|
| Schlagworte: | |
| Online-Zugang: | Inhaltsverzeichnis |
| Beschreibung: | VII, 180 S. Ill., graph. Darst. |
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INHALTSVERZEICHNIS
I
INHALTSVERZEICHNIS
1
EINLEITUNG
1
1.1
MORBUS
CROHN
UND
COLITIS
ULCEROSA
.
1
1.2
AUFBAU
DER
DARMWAND
.
4
1.3
MOEGLICHE
KOMPLIKATIONEN
BEI
MORBUS
CROHN
UND
COLITIS
ULCEROSA
.
5
1.3.1
GESTOERTE
WUNDHEILUNG
UND
BILDUNG
VON
FISTELN
.
5
1.3.2
UEBERSCHIESSENDE
WUNDHEILUNG
UND
ENTSTEHUNG
VON
STENOSEN
.
6
1.4
MIGRATION
VON
FIBROBLASTEN
UND
MYOFIBROBLASTEN
.
8
1.5
MORPHOLOGIE
SICH
BEWEGENDER
FIBROBLASTEN:
MIKROSPIKES
UND
LAMELLIPODIEN
.
10
1.6
DIE
MIGRATION
VON
TIERISCHEN
ZELLEN
IST
AKTIN-ABHAENGIG
.
11
1.7
WACHSTUMSFAKTOREN,
ZYTOKINE
UND
FIBRONEKTIN
UND
DEREN
BEDEUTUNG
FUER
DIE
ZELLMIGRATION
.
13
1.7.1
WACHSTUMSFAKTOREN
.
14
1.7.2
DAS
CHEMOKIN
MCP-1
.
15
1.7.3
ENTZUENDLICHE
MEDIATOREN:
TNF
UND
IFN-Y
.
16
1.7.4
DIE
EXTRAZELLULAERMATRIX-KOMPONENTE
FIBRONEKTIN
.
17
1.8
MECHANISMEN
DER
MIGRATION
MESENCHYMALER
ZELLEN
UND
ROLLE
DER
FOCAL
ADHESION
KINASE
(FAK)
.
18
1.9
ARBEITSZIELE
.
-
.
23
2
MATERIALIEN
UND
GERAETE
26
2.1
CHEMIKALIEN
UND
KIA
.
26
2.1.1
ZELLKULTUR
.
26
2.1.2
IMMUNHISTOCHEMIE
.
27
2.1.2.1
ANTIKOERPER
.
27
2.1.2.2
ISOTYPKONTROLLE
.
28
INHALTSVERZEICHNIS
N
2.1.3
MIGRATIONS-ARSAYS
IN
DER
MODIFIZIETEN
BOYDEN-KAMMER
.
28
2.1.3.1
ZYTOKINE
UND
WACHSTUMSFAKTOREN
.
28
2.1.3.2
EXTRAZELHILAER-MATRIX
PROTEIN
.
28
2.1.3.3
ANTIKOERPER,
ISOTYP-KONTROLLEN
UND
INHIBITOREN
.
29
2.1.4
ZELLZYKLUS-ANALYSE
UND
VITALITAETS-ARSAY.
29
2.1.4.1
ZELLZYKLUS-ANALYSE
.
29
2.1.4.2
VITALITAETS-ARS^
.
29
2.1.5
ENZYME-LINKED
IMMUNOSORBENT
ASSAYS
(ELISAS)
.
30
2.1.6
INUNUNPRAEZIPITATION
UND
DOT
BLOT
.
30
2.1.7
WESTERN
BLOT
UND
VORARBEITEN
.
31
2.1.7.1
LYSEPUFFER
.
31
2.1.7.2
PROTEINBESTINUNUNG
.
31
2.1.7.3
GROESSENSTANDARDS
(MARICER)
.
31
2.1.7.4
GRADIENTENGELE
.
31
2.1.7.5
RUNNING
UND
TRANSFER-PUFFER
.
32
2.1.7.6
WASCHPUFFER
.
32
2.1.7.7
DETEKTION
.
32
2.1.7.8
ANTIKOERPER
.
32
2.1.7.9
POSITIV-KONTROLLE
.
33
2.1.7.10
STRIPPING
.
33
2.2
SONSTIGE
VERBRAUCHSMATERIALIEN
.
34
2.3
GERAETE
.
35
3
METHODEN
37
3.1
ISOLATION
UND
KULTUR
VON
PRIMAEREN
HUMANEN
INTESTINALEN
MYOFIBROBLASTEN
.
37
3.2
HERSTELLUNG
VON
KONDITIONIERTEN
MEDIEN
.
41
3.3
FRAKTIONIERUNG
VON
KONDITIONIERTEM
MEDIUM
.
41
3.4
WEITERE
METHODEN
DER
ZELLKULTUR
.
42
3.4.1
BESTIMMUNG
DER
ZELLZAHL
.
42
3.4.2
EINFRIEREN
DER
ZELLEN
.
43
3.4.3
AUFTAUEN
DER
ZELLEN
.
44
INHALTSVERZEICHNIS
M
3.5
IMMUNHISTOCHEMISCHE
FAERBUNG
.
-
.
-
.
44
3.5.1
AUSSAAT
DER
ZELLEN
AUF
8-WELL-CHAMBER-SLIDES:
.
44
3.5.2
FIXIERUNG
DER
ZELLEN
.
44
3.5.3
FAERBEVERFAHREN
MIT
UNIVERSAL-DAKO-APAAP-KIT
.
.
45
3.5.3.1
ALLGEMEINES
ZUR
METHODE
.
-
.
45
3.5.3.2
BESCHREIBUNG
DER
TECHNIK
.
46
3.6
XTT-TEST
ZUR
UEBERPRUEFUNG
DER
ZELL-VITALITAET
.
48
3.6.1
ALLGEMEINES
ZUR
METHODE
.
48
3.6.2
BESCHREIBUNG
DER
TECHNIK
.
48
3.7
ZELLZYKLUS-ANALYSE:
DNA-FAERBUNG
MIT
PROPIDIUMIODID
.
49
3.7.1
ALLGEMEINES
ZUR
METHODE
.
.
.
49
3.7.2
BESCHREIBUNG
DER
TECHNIK
.
51
3.7.3
DUBLETTEN-DISKRIMINIERUNG
.
52
3.8
MIGRATIONS-ESSAYS
MIT
DER
MODIFIZIERTEN
48-JFE//-BOYDEN-KAMMER
.
53
3.8.1
ARBEITSSCHRITTE
MIT
DER
MODIFIZIERTEN
BOYDEN-KAMMER
.
54
3.8.2
FAERBEN
DER
MIGRIERTEN
ZELLEN
AUF
DER
MEMBRAN
.
56
3.9
NACHWEIS
VON
WACHSTUMSFAKTOREN,
MCP-1
UND
FIBRONEKTIN
IM
KONDITIONIERTEN
MEDIUM
MITTELS
ENZYME-LINKED
IMMUNOSORBENT
ASSAY
(ELISA)
.
57
3.9.1
KONDITIONIERUNG
VON
MEDIEN
UND
ANSCHLIESSENDE
LYSE
DER
ZELLEN
.
58
3.9.2
NACHWEIS
VON
PDGF-AB,
PDGF-BB,
TGF-SSL,
BFGF,
EGF,
IGF-I
UND
MCP
1
MITTELS
SANDWICH-ENZYME-LINKED
IMMUNOSORBENT
ASSAY
(ELISA)
.
58
3.9.3
NACHWEIS
VON
FIBRONEKTIN
MITTELS
COMPETITIVE
INHIBITION
ENZYM-LINKED
IMMUNOSORBENT
ASSAY
(ELISA)
-
.
59
3.10
VORARBEITEN
FUER
DEN
NACHWEIS
DER
FOCAL
ADHESION
KINASE
(FAK)
UND
DEREN
PHOSPHORYLIERUNG
AUF
PROTEIN-EBENE
.
60
3.10.1
VERWUNDUNG
EINES
KONFLUENTEN
MONOLAYERS
UND
INDUKTION
DER
MIGRATION
VON
INTESTINALEN
FIBROBLASTEN
.
60
3.10.2
LYSE
DER
FIBROBLASTEN
.
62
3.10.3
BICINCHONINIC
ACID-TEST
ZUR
PROTEINBESTIMMUNG
.
.
62
INHALTSVERZEICHNIS
IV
3.11
NACHWEIS
VON
FOCAL
ADHESION
KINASE
(FAK)
MITTELS
GELELEKTROPHORESE
UND
WESTERN
BLOTTING
.
63
3.11.1
ELEKTROPHORETISCHE
EIGENSCHAFTEN
VON
PROTEINEN
UND
STRUKTUR
VON
POLYACRYLAMIDGELEN
.
63
3.11.2
SDS-POLYACRYLAMIDGELELEKTROPHORESE
(SDS-PAGE)
.
64
3.11.3
VORBEHANDLUNG
DER
PROTEIN-PROBEN
.
66
3.11.4
BELADEN
DES
GELS
UND
ELEKTROPHORESE
.
67
3.11.5
WESTEM-BLOTTING:
TRANSFER
DER
PROTEINE
AUS
DEM
POLYACRYLAMIDGEL
AUF
EINE
TRAEGERMEMBRAN
.
67
3.11.6
PONCEAU
S-FAERBUNG
UND
IMMUNOBLOTTING
.
69
3.11.7
PROTEINDETEKTION
DURCH
CHEMILUMINESZENZ
.
70
3.11.7.1
ALLGEMEINES
ZUR
METHODE
.
70
3.11.7.2
BESCHREIBUNG
DER
TECHNIK
.
71
3.11.8
STRIPPING
.
71
3.11.9
NACHWEIS
DER
GLEICHMAESSIGEN
PROTEIN-BELADUNG
DURCH
EIN
HOUSE
KEEPING-PROTEIN
.
71
3.12
IMMUNPRAEZIPITATION
VON
FIBRONEKTIN
AUS
KONDITIONIERTEM
MEDIUM
.
72
3.12.1
PRECLEARING
UND
ANTIKOERPER-BINDUNG
.
72
3.12.2
PRAEZIPITATION
.
73
3.13
DORB/OR-TECHNIK
.
73
4
ERGEBNISSE
75
4.1
IMMUNHISTOCHEMISCHE
UNTERSUCHUNG
DER
PRIMAEREN
ZELLKULTUR
.
75
4.1.1
IMMUNHISTOCHEMISCHE
CHARAKTERISIERUNG
DER
PRIMAERKULTUREN
VON
HUMANEN
INTESTINALEN
MYOFIBROBLASTEN
.
75
4.1.1.1
ANTI-FIBROBLASTEN
ANTIKOERPER
AS02
.
76
4.1.1.2
ANTI-VIMENTIN
ANTIKOERPER
.
76
4.1.1.3
ANTI-VINCULIN
ANTIKOERPER
.
77
4.1.1.4
ANTI-A-SMOOTH
MUSCLE
AKTIN
ANTIKOERPER
.
78
4.1.1.5
ANTI-MYOSIN
ANTIKOERPER
.
79
4.1.1.6
ANTI-DESMIN
ANTIKOERPER
.
80
INHALTSVERZEICHNIS
V
4.1.1.7
ZUSAMMENFASSUNG
DER
IMMUNHISTOCHEMISCHEN
CHARAKTERISIERUNG
DER
MYOFIBROBLASTEN
.
81
4.1.1.8
ZUSAMMENFASSUNG
DER
ISOTYP-KONTROLLEN
ALLER
IMMUNHISTO
CHEMISCHEN
MARKIERUNGEN
.
82
4.12
SICHERSTELLUNG
DER
REINHEIT
DER
KULTUREN
VON
INTESTINALEN
MYOFIBROBLASTEN
83
4.2
MIGRATIONSEXPERIMENTE
MIT
DER
MODIFIZIERTEN
BOYDEN-KAMMER
.
84
4.2.1
VALIDIERUNG
DER
MIGRATIONS-ESSAYS:
MYOFIBROBLASTEN-MIGRATION
IST
DURCH
MYOFIBROBLASTEN
KONDITIONIERTE
MEDIEN
INDUZIERBAR
.
84
4
2.
1.1
ZEITABHAENGIGKEIT
DER
MYOFIBROBLASTEN-MIGRATION
.
84
4.2.1.2
ABHAENGIGKEIT
DER
MIGRATIONSINDUKTION
VON
DER
KONZENTRATION
DES
KONDITIONIERTEN
MEDIUMS
.
86
42.1.3
CHECKERBOARD-ANALYSE
.
87
42.2
EINFLUSS
VON
WACHSTUMSFAKTOREN
UND
MCP-1
AUF
DAS
MIGRATIONSVERHALTEN
VON
MYOFIBROBLASTEN
.
89
4.22.1
ZUGABE
VON
PDGF-AB
ZUM
KONDITIONIERTEN
MEDIUM
STEIGERT
DIE
MIGRATION
VON
MYOFIBROBLASTEN
DOSISABHAENGIG
.
90
4.222
ZUGABE
VON
IGF-I
ZUM
KONDITIONIERTEN
MEDIUM
STEIGERT
DIE
MIGRATION
VON
MYOFIBROBLASTEN
DOSISABHAENGIG
.
92
4.22.3
ZUGABE
VON
EGF
ZUM
KONDITIONIERTEN
MEDIUM
STEIGERT
DIE
MIGRATION
VON
MYOFIBROBLASTEN
DOSISABHAENGIG.
93
42.2.4
ZUGABE
VON
TGF-SSL
ZUM
KONDITIONIERTEN
MEDIUM
STEIGERT
DIE
MIGRATION
VON
MYOFIBROBLASTEN
DOSISABHAENGIG
.
94
4.22.5
ZUGABE
VON
BFGF
ODER
MCP-1
ZUM
KONDITIONIERTEN
MEDIUM
HAT
KEINEN
EINFLUSS
AUF
DIE
MIGRATION
VON
MYOFIBROBLASTEN
.
95
42.3
QUANTIFIZIERUNG
VON
WACHSTUMSFAKTOREN
UND
MCP-1
IN
KONDITIONIERTEN
MEDIEN
VON
MYOFIBROBLASTEN
.
96
42.3.1
QUANTITATIVE
BESTIMMUNG
VON
PDGF-AB
IN
KONDITIONIERTEN
MEDIEN
VON
KONTROLL-MYOFIBROBLASTEN
MITTELS
ELISA
.
96
42.3.2
QUANTITATIVE
BESTIMMUNG
VON
TGF-SSL
IN
KONDITIONIERTEN
MEDIEN
VON
KONTROLL-MYOFIBROBLASTEN
MITTELS
ELISA
.
97
42.3.3
QUANTITATIVE
BESTIMMUNG
VON
BFGF
IN
KONDITIONIERTEN
MEDIEN
VON
KONTROLL-MYOFIBROBLASTEN
MITTELS
ELISA
.
98
INHALTSVERZEICHNIS
VI
4.23.4
QUANTITATIVE
BESTIMMUNG
VON
MCP-1
IN
KONDITIONIERTEN
MEDIEN
VON
KONTROLL-MYOFIBROBLASTEN
MITTELS
ELISA
.
99
4.2.4
NEUTRALISATION
DER
ZYTOKINE
IM
KONDITIONIERTEN
MEDIUM
DURCH
ANTIKOERPER
ODER
INHIBITOR
.
100
4.2.4.1
NEUTRALISATION
VON
PDGF
IM
KONDITIONIERTEN
MEDIUM
.
101
4.2.4.2
NEUTRALISATION
VON
MCP-1
IM
KONDITIONIERTEN
MEDIUM
.
103
4.2.43
NEUTRALISATION
VON
TGF-SSL
IM
KONDITIONIERTEN
MEDIUM
.
104
4.2.5
INDUKTION
DER
MIGRATION
DURCH
FIBRONEKTIN
.
104
4.2.5.1
FRAKTIONIERUNG
VON
KONDITIONIERTEM
MEDIUM
.
104
4.2.5.2
IMMUNPRAEZIPITATION
VON
FIBRONEKTIN
AUS
KONDITIONIERTEM
MEDIUM
.
105
4.2.53
FIBRONEKTIN
INDUZIERT
EINE
DOSISABHAENGIGE
MIGRATION
VON
MYOFIBROBLASTEN
.
108
4.2.6
MORBUS
CROHN-MYOFIBROBLASTEN
UND
COLITIS
ULCEROSA-MYOFIBROBLASTEN
ZEIGEN
IN
VITRO
EIN
REDUZIERTES
MIGRATIONSPOTENTIAL
.
110
4.2.7
IFN-Y
UND
TNF
REDUZIEREN
DAS
MIGRATIONSPOTENTIAL
VON
MYOFIBROBLASTEN.
112
4.2.7.1
ZUSATZ
VON
IFN-Y
ODER
TNF
INS
KONDITIONIERTE
MEDIUM
INHIBIERT
DIE
MIGRATION
VON
KONTROLL-MYOFIBROBLASTEN
DOSISABHAENGIG
.
112
4.2.7.2
REDUKTION
DER
MIGRATION
VON
KONTROLL-MYOFIBROBLASTEN
DURCH
VORINKUBATION
MIT
IFN-Y
UND
TNF
.
115
4.2.73
DAUERHAFT
REDUZIERTE
MIGRATION
VON
KONTROLL-MYOFIBROBLASTEN
DURCH
VORINKUBATION
MIT
IFN-Y
UND
TNF
.
117
4.2.7.4
IFN-Y
UND
TNF
BEEINFLUSSEN
DIE
VITALITAET
DER
MYOFIBROBLASTEN
KAUM.
119
4.2.7.5
ZELLZYKLUS-ANALYSE:
EINFLUSS
ENTZUENDLICHER
MEDIATOREN
AUF
DEN
ZELL
METABOLISMUS
.
122
43
DAS
REDUZIERTE
MIGRATIONSPOTENTIAL
VON
CED-MYOFIBROBLASTEN
WIRD
VON
EINER
ABNAHME
DER
FOCAL
ADHESION
KINASE
(FAK)
UND
DEREN
PHOSPHORYLIERUNG
BEGLEITET
.
128
43.1
REGULATION
VON
FAK
UND
DER
PHOSPHORYLIERUNG
AM
TYROSIN
397
IN
KONTROLL-,
MORBUS
CROHN
UND
COLITIS
ULCEROSA-MYOFIBROBLASTEN
.
128
4.3.2
REGULATION
VON
FAK
UND
DER
PHOSPHORYLIERUNG
AM
TYROSIN
397
IN
KONTROLL-MYOFIBROBLASTEN
NACH
3
TAGEN
INKUBATION
MIT
IFN-Y
UND/ODER
TNF
.
132
INHALTSVERZEICHNIS
VII
43.3
REGULATION
VON
FAK
UND
DER
PHOSPHORYLIERUNG
AM
TYROSIN
397
IN
KONTROLL-MYOFIBROBLASTEN
NACH
3
TAGEN
INKUBATION
MIT
IFN-Y
UND/ODER
TNF
UND
ANSCHLIESSENDER
7-TAEGIGER
NORMALKULTUR
.
136
5
DISKUSSION
141
5.1
AUTOKRINE
FIBRONEKTIN-INDUZIERTE
MIGRATION
VON
INTESTINALEN
MYOFIBROBLASTEN
141
5.2
WACHSTUMSFAKTOREN
BEEINFLUSSEN
DIE
MIGRATION
VON
INTESTINALEN
MYOFIBROBLASTEN
.
143
5.3
IFN
Y
UND
TNF
REDUZIEREN
DAS
MIGRATIONSPOTENTIAL
VON
KONTROLL
MYOFIBROBLASTEN
.
146
5.4
ROLLE
DER
FOCAL
ADHESION
KINASE
(FAK)
WAEHREND
DER
MIGRATION
VON
MYOFIBROBLASTEN
.
150
53
MYOFIBROBLASTEN-MIGRATION
IM
KONTEXT
DER
WUNDHEILUNG
UND
FIBROSIERUNG
.
154
6
ZUSAMMENFASSUNG
156
7
AUSBLICK
159
8
LITERATURVERZEICHNIS
161
9
ANHANG
174
9.1
ORIGINALARBEITEN
.
174
9.2
VEROEFFENTLICHTE
KURZFASSUNGEN
.
.
.
175
93
WEITERE
KONGRESSBEITRAEGE
.
178
10
DANKSAGUNG
179 |
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