DNA-Bindung des Transkriptionsfaktors ABF1 aus S. cerevisiae: Spezifität und Kontaktpunkte
Gespeichert in:
| 1. Verfasser: | |
|---|---|
| Format: | Buch |
| Sprache: | German |
| Veröffentlicht: |
2002
|
| Schlagworte: | |
| Online-Zugang: | Inhaltsverzeichnis |
| Beschreibung: | Bayreuth, Univ., Diss., 2002. - Auch als Online-Diss. mit der URL: http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:703-opus-255 |
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I
NHALTSVERZEICHNIS
INHALTS
VERZEICHNIS
ABKUERZUNGSVERZEICHNIS
.
VI
1.
EINLEITUNG
.
1
1.1.
ARS
BINDING
FACTOR
1
(ABFI)
AUS
S.
CEREVISIAE
.
1
12.
UV-INDUZIERTE
QUERVERNETZUNGEN
VON
PROTEINEN
MIT
DNA
.
6
13.
BIOSENSOREN
UND
IHRE
ANWENDUNG
FUER
DIE
UNTERSUCHUNG
DER
REAKTIONSKINETIK
.
8
1.4.
IN
VITRO
SELEKTION
FUNKTIONELLER
PROTEIN
UND
NUKLEINSAEUREMOLEKUELE
.
11
1.4.1.
GRUNDLAGEN
UND
ANWENDUNGEN
.
11
1.4.2.
SELEKTIONSEXPERIMENTE
IN
VITRO
FUER
DIE
CHARAKTERISIERUNG
VON
PROTEIN-NUKLEINSAEURE
WECHSELWIRKUNGEN
.
14
15.
ZIELSETZUNG
DIESER
ARBEIT
.
16
2.
MATERIALIEN
.
17
2.1.
CHEMIKALIEN
UND
REAGENZIEN
.
17
2.1.1.
ALLGEMEINE
CHEMIKALIEN
.
17
2.1.2.
RADIOCHEMIKALIEN
.
17
2.1.3.
PROTEINE
UND
ENZYME
.
17
2.1.4.
CHROMATOGRAPHIEMATERIALIEN
.
18
2.1.5.
DNA
UND
PROTEINSTANDARDS
.
18
22.
BAKTERIENSTAEMME
UND
PLASMIDE
.
18
23.
OLIGODESOXYRIBONUKLEOTIDE
.
19
2.4.
NAEHRMEDIEN
UND
LOESUNGEN
.
22
25.
KOMMERZIELLE
KITS
.
25
2.5.1.
DNA
REINIGUNGS
UND
MODIFIKATIONSKITS
.
25
2.5.2.
PROTEIN-BESTIMMUNGS-,
REINIGUNGS
UND
MODIFIKATIONSKITS
.
25
2.6.
GERAETE
UND
ANDERE
MATERIALIEN
.
25
3.
METHODEN.
27
3.1.
STANDARDMETHODEN
.
27
3.1.1.
KONZENTRATIONSBESTIMMUNG
VON
DNA
UND
PROTEINEN
.
27
3.1.1.1.
UV-SPEKTROMETRIE
.
27
3.1.1.2.
COLORIMETRISCHE
PROTEINKONZENTRATIONSBESTIMMUNG
.
27
3.1.2.
VISUALISIERUNG
VON
PROTEINEN
UND
DANN
.
27
3.12.1.
COOMASSIE-FAERBUNG
.
27
3.1.22.
SILBERFARBUNG
.
28
3.12.3.
ETHIDIUMBROMIDFAERBUNG
.
28
3.12.4.
PVDF-MEMBRAN
FAERBUNG
MIT
AMIDOSCHWARZ
.
28
3.1.2.5.
DETEKTION
VON
RADIOAKTIV
MARKIERTEN
PROBEN
.
28
3.1.3.
DNA
HYBRIDISIERUNG
.
28
3.1.4.
PROTEINTRANSFER
AUF
PVDF-MEMBRAN
.
28
II
I
NHALTSVERZEICHNIS
3.1.5.
ANZUCHTBEDINGUNGEN
FUER
BAKTERIEN
UND
HEFE
.
29
3.1.6.
HERSTELLUNG
KOMPETENTER
ZELLEN
UND
TRANSFORMATION
VON
DNA
.
29
3.1.6.1.
CACLR-KOMPETENTE
ZELLEN
.
29
3.1.6.2.
ELEKTROPORATION
.
30
3.2.
STANDARDMETHODEN
FUER
GELELEKTROPHORESE
.
_
.30
3.2.1.
AGAROSE-GELELEKTROPHORESE
.
30
3.2.2.
NATIVE
POLYACRYLAMIDGELELEKTROPHORESE
(PAGE)
.
30
3.2.3.
DENATURIERENDE
POLYACRYLAMIDGELELEKTROPHORESE
(PAGE)
.
31
3.2.4.
SDS-PAGE
NACH
LAEMMLI
.
31
3.2.5.
SDS-PAGE
NACH
SCHAEGGER-JAGOW
.
31
33.
ISOLIERUNG
UND
REINIGUNG
VON
DNA
.
32
3.3.1.
PHENOLEXTRAKTION
UND
ETHANOLFAELLUNG
.
32
3.3.2.
PLASMIDISOLIERUNG
IM
ANALYTISCHEN
MASSSTAB
.
32
3.3.3.
REINIGUNG
VON
OLIGONUKLEOTIDEN
UND
PCR-PRODUKTEN
UEBER
PAGE
.
32
3.3.4.
REINIGUNG
DER
DNA-SPALTUNGS
UND
PCR-PRODUKTEN
.
33
3.4.
ENZYMATISCHE
BEHANDLUNG
VON
DNA
.
33
3.4.1.
ENZYMATISCHER
DNA-VERDAU
UND
DEPHOSPHORYLIERUNG
.
33
3.4.2.
5
'
-PHOSPHORYLIERUNG
MIT
T4
POLYNUKLEOTIDKINASE
.
33
3.4.3.
LIGATION
.
33
3.4.4.
DNA-AMPLIFIKATION
(PCR)
.
34
3.4.4.I.
KOLONIEN-PCR
.
34
3.4.4.2.
YYINGEL
"
-PCR
.
34
3.4.4.3.
PCR-VERMITTELTE
ERZEUGUNG
EINES
EXPRESSIONSVEKTORS
.
34
3.4.4.4.
PCR-VERMITTELTE
ERZEUGUNG
VON
ARS1-ELEMENT
.
35
3.5.
CHROMATOGRAPHISCHE
ABFL-REINIGUNG
.
35
3.5.1.
UEBEREXPRESSION
VON
ABFI
IN
E.
COLI
.
35
3.5.2.
FPLC-UNTERSTUETZTE
SAEULENCHROMATOGRAPHIE
.
36
3.5.2.I.
ANREICHERUNG
VON
ABFI
UEBERNI
2+
-AFFINITAETSCHROMATOGRAPHIE
.
36
3.5.2.2.
REINIGUNG
VON
ABFI
MITTELS
LONENAUSTAUSCH-CHROMATOGRAPHIE
.
36
3.5.3.
REINIGUNG
VON
ABFI
IN
ANALYTISCHEM
MASSSTAB
.
36
3.5.4.
GELFILTRATION
MITTELS
HPLC
.
37
3.6.
UNTERSUCHUNG
DER
ABFL-DNA-WECHSELWIRKUNG
.
37
3.6.1.
GELRETARDATIONSEXPERIMENTE
.
37
3.6.2.
DNA-SELEKTION
IN
VITRO
.
38
3.6.3.
SPR-MESSUNG
DER
ABFI-DNA-BINDUNGSKINETIK
.
38
3.6.4.
QUERVEMETZUNGSEXPERIMENTE
.
40
3.6.4.I.
LASERVERMITTELTE
PHOTOQUERVEMETZUNG
.
40
3.6.4.2.
PROTEIN-DNA-QUERVEMETZUNG
MITTELS
UV-B
UND
UV-C
BESTRAHLUNG
.
40
3.OE.4.3.
CHEMISCHE
PROTEIN-PROTEIN-QUERVEMETZUNG
.
40
3.7.
REINIGUNG
UND
UNTERSUCHUNG
VON
ABFL-DNA-QUERVERNETZUNGSPRODUKTEN
.
41
3.7.1.
ELUTION
AUS
PRAEPARATIVEM
LAEMMLI-GEL
.
41
3.7.1.1.
DIFFUSIONSBEDINGTE
ELUTION
AUS
SDS-PAAG
.
41
3.7.1.2.
ELEKTROELUTION
.
41
3.7.2.
FAELLUNG
UND
KONZENTRIERUNG
DES
PROTEIN-DNA-KOMPLEXES
.
41
3.7.2.I.
ACETONFAELLUNG
.
41
3.7.2.2.
PHENOL/ETHER
EXTRAKTION
.
42
3.7.2.3.
METHANOL/CHLOROFORM
PRAEZIPITATION
.
42
I
NHALTSVERZEICHNIS
III
3.7.2.4.
QIAEX
II
PROTOKOLL
FUER
DNA-REINIGUNG
UND
KONZENTRIERUNG
.
42
3.7.3.
CHROMATOGRAPHISCHE
REINIGUNG
DES
KOVALENTEN
ABFI
-DNA-KOMPLEXES
BZW.
SPALTUNGSPRODUKTES
.
42
3.7.4.
CHEMISCHE
SPALTUNG
UND
ENZYMATISCHER
VERDAU
DER
QUERVEMETZUNGSPRODUKTEN
.
43
3.7.4.1.
LIMITIERENDER
ABFI-DNA
SPALTUNG
MIT
TRYPSIN
UND
ANALYSE
ERHALTENER
FRAGMENTEN
.
43
3.7.4.2.
ENZYMATISCHER
VERDAU
.
43
3.7.4.3.
PROTEINSPALTUNG
MIT
HYDROXYLAMIN
.
44
3.7.4.4.
CHEMISCHE
PROTEINSPALTUNG
MIT
NTCB
.
44
3.7.4.5.
DNA-SPALTUNG
MIT
PHOSPHODIESTERASEN
.
44
3.7.5.
UNTERSUCHUNG
DER
SPALTUNGSPRODUKTE
MITTELS
MALDI-MS
.
44
4.
ERGEBNISSE
.
47
4.1.
PRAEPARATION
VON
ABFI
UND
ANALYSE
DER
ABFL-MULTIMERISIERUNG
.
47
4.1.1.
SAEULENCHROMATOGRAPHISCHE
REINIGUNG
DES
REKOMBINANTEN
ABFI-PROTEINS
.
47
4.1.2.
ANALYSE
DER
DIMERBILDUNG
DES
ABF
1
-PROTEINS
.
49
4.1.3.
UEBEREXPRESSION
UND
REINIGUNG
DER
ABFL-DOMAENE
.
50
4.2.
DNA-BINDUNGSEIGENSCHAFTEN
VON
ABFI
.
51
4.2.1.
UNTERSUCHUNG
DER
ABFI-BINDESEQUENZ
MITTELS
DNA-SELEX
.
51
4.2.1.1.
BESTIMMUNG
DER
DNA-BINDESEQUENZ
IN
VITRO
.
52
4.2.1.2.
VERGLEICH
DER
DNA-BINDESEQUENZEN
UND
BESTIMMUNG
DES
KONSENSUSMOTIVS
FUER
DIE
ABFL-BINDUNG
.
54
4.2.2.
BESTIMMUNG
DER
BINDUNGSAFFINITAET
ZWISCHEN
DNA
UND
ABFI
.
59
4.2.2.1.
KO-BESTIMMUNG
FUER
OLIGONUKLEOTIDE
NACH
SELEX
.
59
4.2.2.2.
ANALYSE
DER
ABFI
-BINDUNGSEIGENSCHAFTEN
MIT
ARS-ELEMENTEN
UND
PROMOTORSEQUENZEN
.
62
4.2.2.3.
ABFL-BINDUNG
AN
METHYLIERTE
ARS
1
-SEQUENZEN
.
67
4.2.3.
BESTIMMUNG
DES
ABFL-OLIGOMERISIERUNGSZUSTANDS
IN
DER
ANWESENHEIT
VON
DNA
.
69
4.2.4.
SPR-ANALYSE
DER
ABF
1
-DNA-REAKTIONSKINETIK
.
70
43.
PHOTOQUERVERNETZUNGSEXPERIMENTE
ZUR
BESTIMMUNG
DER
ABF1-DNA
KONTAKTPUNKTE
.
80
4.3.1.
OPTIMIERUNG
DER
QUERVEMETZUNGSBEDINGUNGEN
.
81
4.3.1.1.
VERGLEICH
DER
OLIGONUKLEOTIDE
IN
QUERVEMETZUNGSEXPERIMENTEN
MIT
ABFI
.
81
4.3.1.2.
OPTIMIERUNG
DER
BEDINGUNGEN
FUER
DIE
QUERVEMETZUNGSREAKTION
ZWISCHEN
ABFI
UND
ARS
1
-ELEMENT
.
82
4.3.2.
BESTIMMUNG
DER
DNA-BINDUNGSDOMAENE
DES
ABFL
'
S
.
83
4.3.2.1.
REINIGUNG
UND
KONZENTRIERUNG
DES
PROTEIN-DNA-KOMPLEXES
.
83
4.3.2.2.
CHEMISCHE
SPALTUNG
DES
ABFL-DNA-QUERVEMETZUNGSPRODUKTES
.
85
4.3.2.3.
TRYPTISCHER
VERDAU
DES
ABFI-DNA-KOMPLEXES
.
86
4.3.3.
IDENTIFIZIERUNG
DER
ABFI-KONTAKTPUNKTE
IM
KOVALENTEN
ABFI-ARS
1
-KOMPLEX
MITTELS
MALDI-MS
.
87
5.
DISKUSSION
.
91
5.1.
UNTERSUCHUNG
DER
ABFL-ERKENNUNGSMOTIVE
AUF
DSDNA
MITTELS
SELEX
EXPERIMENTEN
.
91
5.2.
SPR-ANALYSE
DER
ABFL-BINDUNGSKINETIK
.
95
53.
ABFL-BINDUNG
AN
DIE
ABFL-SPEZIFISCHE
DNA
AUS
S.
CEREVISIAE
.
97
IV
I
NHALTSVERZEICHNIS
5.4.
VERGLEICH
DER
METHODEN
FUER
DIE
UNTERSUCHUNG
DER
PROTEIN-DNA-BINDUNG
_
.99
5.5.
EINFLUSS
DER
DNA-METHYLIERUNG
AUF
DIE
PROTEIN-BINDUNG
.
.
102
5.6.
BESTIMMUNG
DER
KONTAKTPUNKTE
IM
ABFI-DNA-KOMPLEX
.
_
.
_
.
.
103
6.
ZUSAMMENFASSUNG.
.
107
7.
SUMMARY
.109
8.
ANHANG.
.
111
8.1.
VERGLEICH
DER
SELEKTIERTEN
SEQUENZEN
MIT
GENOMISCHER
S.
CEREVISIAE
DNA.
_
.
_
.
111
8.2.
BERECHNUNG
DER
GLEICHGEWICHTSKONSTANTEN
.
113
83.
BERECHNUNG
DER
GESCHWINDIGKEITSKONSTANTEN
.
114
8.3.1.
ASSOZIATIONSKINETIK
.
114
8.3.2.
DISSOZIATIONSKINETIK
.
116
8.3.3.
BERECHNUNG
DER
STANDARDABWEICHUNG
.
117
8.4.
ZUSAMMENFASSUNG
DER
ABFL-DNA-BINDUNGSKONSTANTEN
NACH
SPR-MESSUNG.
.118
8.5.
MITTELS
MALDI-MS
IDENTIFIZIERTE
ABFL-PEPTIDE
.
120
9.
LITERATURVERZEICHNIS.
.
123 |
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| discipline | Biologie |
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| record_format | marc |
| spelling | Beinoravičiūtė-Kellner, Rasa Verfasser aut DNA-Bindung des Transkriptionsfaktors ABF1 aus S. cerevisiae Spezifität und Kontaktpunkte vorgelegt von Rasa Beinoravičiūtė-Kellner 2002 VII, 134 S. graph. Darst. txt rdacontent n rdamedia nc rdacarrier Bayreuth, Univ., Diss., 2002. - Auch als Online-Diss. mit der URL: http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:703-opus-255 DNS-Bindung (DE-588)4150337-5 gnd rswk-swf Transkriptionsfaktor (DE-588)4303350-7 gnd rswk-swf Saccharomyces cerevisiae (DE-588)4178812-6 gnd rswk-swf (DE-588)4113937-9 Hochschulschrift gnd-content Saccharomyces cerevisiae (DE-588)4178812-6 s Transkriptionsfaktor (DE-588)4303350-7 s DNS-Bindung (DE-588)4150337-5 s DE-604 DNB Datenaustausch application/pdf http://bvbr.bib-bvb.de:8991/F?func=service&doc_library=BVB01&local_base=BVB01&doc_number=010203681&sequence=000001&line_number=0001&func_code=DB_RECORDS&service_type=MEDIA Inhaltsverzeichnis |
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