Klonierung, Expression und funktionelle Charakterisierung des Kaliumkanals rSK4 aus dem Kolon der Ratte:
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2000
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1
INHALT
ABKUERZUNGSVERZEICHNIS 4
1. EINLEITUNG_ 5
1.1. KOLONFUNKTION 5
1.2. MECHANISMUS DER SEKRETION 6
1.3. REGULATION DER SEKRETION 7'
1.4. BASOLATERALE IC-LEITFAEHIGKEITEN 8
1.5. DAS SK4-HOMOLOG DER RATTE ALS KANDIDAT FUER DEN CA
2+-
ABHAENGIGEN K*-KANAL (SKC
A) DER BASOLATERALEN MEMBRAN 8
1.6. ZIELE DER ARBEIT 9
\
2. MATERIAL UND METHODEN_10
2.1. MOLEKULARBIOLOGISCHE METHODEN 10
2.1.1. ISOLATION VON BOTEN-RIBONUKLEINSAEURE (MRNA) 10
2.1.1. REVERSE TRANSKRIPTION (RT) 10
2.1.2. REINIGUNG VON DNA IN WAESSRIGER LOESUNG 11
2.1.3. POLYMERASE KETTENREAKTION 11
2.1.4. HERSTELLUNG STUMPFER ENDEN (BLUNT ENDS) 12
2.1.5. AMPLIFIKATION UNBEKANNTER CDNA-ENDEN (RACE-PCR) 12
2.1.6. PHOTOMETRIE 15
2.1.7. GELELEKTROPHORESE 15
2.1.8. GELREINIGUNG 15
2.1.10 RESTRIKTIONSVERDAU 16
2.1.11 PLASMIDE 16
2.1.12 LIGATION 17
2.1.13 TRANSFORMATION 17
2.1.14 PRAEPARATION VON PLASMID-DNA 17
2.1.15 SEQUENZIERUNG 18
2.1.16 ANALYSE VON PROTEINSTRUKTUREN 18
2.1.17 GERAETE 18
2.1.18 OLIGONUKLEOTIDE 19
BIBLIOGRAFISCHE INFORMATIONEN
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2
2.2. EXPRESSIONSSYSTEM 19
2.2.1. DAS XENOPUS OOZYTEN SYSTEM 19
2.2.2. GEWINNUNG UND AUFBEWAHRUNG VON OOZYTEN 20
2.2.3. HERSTELLUNG UND INJEKTION DER CRNA . 20
2.3. ELEKTROPHYSIOLOGISCHE METHODEN 21
2.3.1. ZWEI-ELEKTRODEN-SPANNUNGSKLEMME (DOUBLE VOLTAGE CLAMP) 21
2.3.2. SAUGELEKTRODENTECHNIK (PATCH CLAMP) 22
2.3.2.1. SAUGELEKTRODEN 23
2.3.2.2. MESSPLATZ ~~ 23
2.3 2.3. SAUGELEKTRODENEXPERIMENTE AN XENOPUS OOZYTEN 25
2.3.2.4. ELEKTRISCHER AUFBAU UND SIGNALVERARBEITUNG 26
2.32.5. MESSVORGANG 26
2.3.3. SUBSTANZEN 26
2.3.4. MEMBRANPOTENTIAL UND LEITWERT 27
2.4. STATISTIK 27
3. ERGEBNISSE^_._
29
3.1. HOMOLOGIEKLONIERUNG EINES RSK4-FRAGMENTS 29
3.2. GEWINNUNG DER 5'- UND 3'-ENDEN 31
3.3. MOLEKULARE STRUKTUR DES RSK4 31
J
3.4. KLONIERUNG UND EXPRESSION DER VOLLSTAENDIGEN RSK4-CDNA 33
3.5. RSK4 STROM IN DER GANZZELLMESSUNG 34
3.6. RSK4 STROM IM EXZIDIERTEN MEMBRANFLECK 36
3.7. CA
2+-ABHAENGIGKEIT DES RSK4 STROMS 36
3.8. EINFLUSS VON ZYKLISCHEN NUKLEOTIDMONOPHOSPHATEN 38
3.9. WIRKUNG VON AKTIVATOREN DER PROTEINKINASE C 39
3.10. WIRKUNG VON K*-KANALBLOCKERN AUF DEN RSK4 40
3.11. WIRKUNG VON IC-KANALAKTIVATOREN AUF DEN RSK4 GANZZELLSTROM 42
3.12. WIRKUNG VON EBIO AM EXZIDIERTEN MEMBRANFLECK 44
4. DISKUSSION_46
4.1. MOLEKUELSTRUKTUR DES RSK4 46
4.2. EXPRESSION IN OOZYTEN 47
4.3. BIOPHYSIKALISCHE EIGENSCHAFTEN 48
4.4. REGULATION DURCH INTRAZELLULAERE BOTENSTOFFE 48
4.4.1. CA
2+ 48
4.4.2. ZYKLISCHE NUKLEOTIDMONOPHOSPHATE 50
4.4.3. AKTIVATOREN DER PROTEINKINASE C 51
4.5. PHARMAKOLOGIE DES RSK4 51
4.5.1. BA
2+ 51
4.5.2. CLOTRIMAZOL 52
4.5.3. PEPTIDTOXINE 52
4.5.4. BENZIMIDAZOLONE 53
4.6. FUNKTION DES RSK4 IM KOLON 53
4.7. WEITERE FUNKTIONEN VON SK4-KANAELEN 54
4.7.1. EPITHELIALER TRANSPORT 55
4.7.2. IMMUNABWEHR 55
4.7.3. ERYTHROZYTEN 55
4.7.4. ZELLULAERE VOLUMENREGULATION 56
4.8. ABSCHLIESSENDE BEMERKUNG 56
5. ZUSAMMENFASSUNG_ 57
6. LITERATURVERZEICHNIS_ _58
7. DANKSAGUN
G _ $7
8. LEBENSLAUF_68 |
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