Modell zur Tumorzelldetektion im Blut mit nested RT-PCR:
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| Published: |
2002
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INHALTS
VERZEICHNIS
1. EINLEITUNG 1
2. MATERIAL UND METHODIK 7
2.1 MATERIALIEN, MEDIEN UND ZUSAETZE 7
2.2 METHODIK 12
2.2.1 VERWENDETE ZELLINIEN 12
2.2.2 METHODIK DER ZELLKULTUR 12
2.2.3 BESTIMMUNG DER ZELLZAHL 13
2.2.4 IMMUNOMAGNETISCHE ISOLIERUNG VON EPITHELIALEN ZELLEN AUS VOLLBLUT
14
2.2.5 RNA-EXTRAKTION 15
2.2.6 OPTIMIERUNG DER RNA-EXTRAKTION - 16
2.2.7 EIN-SCHRITT RT-PCR 16
2.2.8 SYNTHESE DER CDNA 18
2.2.9 OPTIMIERUNG DER CDNA-SYNTHESE UNTER BERUECKSICHTIGUNG DER PRIMER
RANDOM HEXAMER VERSUS OLIGO D(T) 19
2.2.10 DURCHFUEHRUNG DER PCR 19
AUSGEWAEHLTE PRIMER 22
STANDARDANSATZ FUER DIE ERSTE PCR 23
STANDARDANSATZ FUER DIE NESTED PCR 24
FRAGMENTLAENGE DER PCR-PRODUKTE 25
V
2.2.11 MARKIERUNG DER PRIMER MIT FLOURESZENZ-FARBSTOFFEN 25
2.2.12 DETEKTION DER FLOURESZENZMARKIERTEN PCR-PRODUKTE 27
2.2.13 GELELEKTROPHORESE 27
3. ERGEBNISSE 31
3.1 RNA-EXTRAKTION 31
3.1.1 VERGLEICH DER RNA-EXTRAKTIONEN MIT UND OHNE ZUGABE
VON POLY (G) 31
3.2 UNTERSUCHUNGSERGEBNISSE DER EIN-SCHRITT RT-PCR 32
3.3 CDNA-SYNTHESE 32
3.3.1 VERGLEICH DER BEIDEN PRIMER FUER DIE CDNA-SYNTHESE:
RANDOM HEXAMER UND OLIGO (DT) 32
BIBLIOGRAFISCHE INFORMATIONEN
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3.4 ETABLIERUNG DER PCR 34
3.4.1 PRIMER-DESIGN 34
3.4.2 PCR-KONDITIONEN 35
3.5 VERGLEICH DER SENSITIVUEAET DER KONVENTIONELLEN PCR MIT
35 ZYKLEN VERSUS NESTED PCR IN EINER VERDIINNUNGSREIHE MIT
ZELLEN DER ZELLINIE HT 29 35
3.6 UNTERSUCHUNGSERGEBNISSE DER TUMORZEUDETEKTION IN EINER
VERDUENNUNGSREIHE AUF DEM POLYACRYLAMIDGEL MIT SUEBETFAERBUNG 37
3.7 SENSITIVUEAET UND SPEZIFITAET DER ZELLDETEKTION NTIT DEM
ABIPRISM
YY
377-SYSTEM 37
3.7.1 NACHWEIS VON 10 TUMORZELLEN MIT CEA-EXPRESSION 38
3.7.2 NACHWEIS VON 10 TUMORZELLEN MIT MUCIN 1 EXPRESSION 43
3.7.3 UNTERSUCHUNG VON KONTROLLBLUT 45
4. DISKUSSION 47
4.1 AUFIAU EINES MODELLSYSTEMS ZUR TUMORZELUSOUERUNG 49
4.1.1 OPTIMIERUNG DER RNA-ISOLIERUNG 50
4.1.2 VERGLEICH DER PRIMER FUER DIE CDNA-SYNTHESE:
RANDOM HEXAMER UND OLIGO (DT) 51
4.1.3 EIN-SCHRITT RT-PCR 51
4.1.4 VERGLEICH DER KONVENTIONELLEN PCR MIT DER NESTED PCR 52
4.1.4 SENSITIVITAET DER TUMORZELLDETEKTION MIT DARSTELLUNG DURCH DAS ABI
-
PRISM
YY
-SYSTEM UND AUF DEM POLYACRYLAMIDGEL MIT SILBERFAERBUNG 53
4.1.5 VERGLEICH DER BEIDEN VERWENDETEN MARKER CEA UND MUC 1 IN
DEM HIER ETABLIERTEN MODELLSYSTEM
4.2 SCHHFIFOLGERUNG 56
4.3 AUSBLICK 56
5. ZUSAMMENFASSUNG 59
6. A BKUERZ UNGS
V
ERZ EICHNIS 61
7. LITERATURVERZEICHNIS 63 |
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