Die Rolle einer konstitutiv-aktiven MAP-Kinase SAPK-Beta bei der zellulären Transformation, Proliferation und Apoptose von NIH-3T3-Fibroblasten:
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INHALTSVERZEICHNIS
1. SUMMARY/ZUSAMMENFASSUNG 1
2. EINLEITUNG 3
2.1 EINFUEHRUNG IN DIE INTRAZELLULAEREN SIGNALTRANSDUKTIONSKASKADEN 3
2.2 DER PROTOTYP DER MITOGEN-AKTIVIERTEN PROTEINKINASE SIGNALWEGE: 7
DIE RAS-RAF-MEK-ERK KASKADE
2.3 DIE STRESS-AKTIVIERTEN PROTEINKINASE KASKADEN 10
2.3.1 DIE ERK5/BMK1 SIGNALKASKADE 10
2.3.2 DER P38 SIGNALWEG 11
2.3.3 SAPK (STRESS-AKTIVIERTE PROTEINKINASE)/JNK (C-JUN N-TERMINALE
KINASE) 12
2.3.3.1 AKTIVIERUNG DER SAPK/JNK KASKADE 12
2.3.3.2 DIE BIOLOGISCHE FUNKTION DER SAPK/JNK SIGNALKASKADE 17
2.3.3.3 GENETISCHE DELETION VON SAPK/JNK KINASEN UND ANDERER KOMPONENTEN
19
DIESER SIGNALKASKADE
2.3.3.4 DIE ROLLE VON SAPK/JNK GESTEUERTEN SIGNALWEGEN BEI DER ONKOGENEN
21
TRANSFORMATION
2.3.3.5 DIE FUNKTION VON SAPK/JNK BEI DER REGULATION APOPTOTISCHER
PROZESSE 22
2.4 REGULIERUNG DER SPEZIFITAET VON MAPK SIGNALKASKADEN 23
2.5 GEGENSTAND DER ARBEIT 27
3. MATERIAL 28
3.1 ARBEITSMATERIAL 28
BIBLIOGRAFISCHE INFORMATIONEN
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3.1.1 GERAETE 28
3.1.2 CHEMIKALIEN 29
3.1.3 VERBRAUCHSMATERIALIEN
30
3.1.4 ZEL LKULTURMATERIAL
3
Q
3.1.5 ENZYME
31
3.1.6 MOLEKULARGEWICHTSMARKER
31
3.1.7 REAGENZIENSAETZE (KITS) 32
3.1.8 ANTIKOERPER
32
3.1.9 PRIMER (OLIGONUKLEOTIDE)
33
3.1.10 PEPTIDE
34
3.2 ZELLLINIEN UND BAKTERIENSTAEMME
35
3.2.1 ZELLLINIEN
35
3.2.2 BAKTERIENSTAEMME
36
3.3 KULTURMEDIEN
36
3.3.1 ZELLKULTURMEDIEN
36
3.3.2 BAKTERIENMEDIEN
37
3.4 PLASMIDE
3
G
3.4.1 EUKARYONTISCHE EXPRESSIONSVEKTOREN
38
3.4.2 EUKARYONTISCHE EXPRESSIONSPLASMIDE 38
4. ARBEITSMETHODEN 41
4.1 ARBEITEN MIT
ESCHERICHIA COLI
41
4.1.1 BAKTERIENKULTUREN
41
4.1.2 HERSTELLUNG ULTRAKOMPETENTER BAKTERIEN 42
4.1.3 TRANSFORMATION VON KOMPETENTEN
E. COLI DH5A 42
4.1.4 PLASMIDISOLATION AUS
E. COLI
43
4.1.4.1 ALKALISCHE LYSE ZUR PLASMID-DNA PRAEPARATION AUS
E. COLI:
43
PRAEPARATIVER MASSSTAB
4.1.4.2 PLASMID-DNA ISOLIERUNG: ANALYTISCHER MASSSTAB
44
4.1.4.3
4.2
4.2.1
4.2.2
4.2.3
4.2.4
4.2.5
4.2.6
4.2.7
4.2.8
4.2.9
4.2.10
4.2.11
4.2.12
4.3
4.3.1
4.3.2
4.3.3
4.3.4
4.3.5
4.3.6
4.3.7
4.3.8
4.3.9
4.3.10
4.3.11
4.4
4.4.1
PLASMID-DNA PRAEPARATION AUS
E. COLI FUER ZELLKULTUR-
TRANSFEKTIONSEXPERIMENTE
MOLEKULARBIOLOGISCHES ARBEITEN MIT DNA
KONZENTRATIONSBESTIMMUNG VON DNA
ELEKTROPHORETISCHE AUFTRENNUNG VON DNA
EXTRAKTION VON DNA AUS EINEM AGAROSEGEL
RESTRIKTIONSVERDAU VON DNA
HERSTELLUNG VON
BLUNT-END DNA-FRAGMENTEN
DEPHOSPHORYLIERUNG VON GESCHNITTENER VEKTOR-DNA MIT CIP
LIGATION VON DNA-FRAGMENTEN
AMPLIFIKATION VON DNA-FRAGMENTEN MIT HILFE DER PCR
ERSTELLUNG VON PUNKTMUTATIONEN MIT HILFE DES QUICKCHANGE
YY
SITE DIRECTED MUTAGENESIS KIT
SYNTHESE KLEINER DOPPELSTRAENGIGER DNA-STUECKE
(IN VITRO ANNEALING)
DNA-AUFREINIGUNG DURCH PHENOLISIERUNG MIT ALKOHOLISCHER FAELLUNG
DNA-SEQUENZIERUNG
ZELLKULTUR
HALTUNG VON EUKARYONTISCHEN ZELLLINIEN IN KULTUR
TRANSIENTE TRANSFEKTION VON SAEUGERZELLEN
RETROVIREN ALS EFFIZIENTE VEKTOREN FUER DEN GENTRANSFER IN SAEUGERZELLEN
TRANSFEKTION VON ZELLEN MIT HILFE DER ZENTRIFUGATIONSINFEKTION
(SPIN-INFECTIORI)
HERSTELLUNG STABILER NIH 3T3 ZELLLINIEN
HERSTELLUNG EINER TETRAZYKLIN-INDUZIERBAREN NIH 3T3 TET-OFF ZELLLINIE
SOFT-AGAR KLONIERUNG
FOCUS-ASSAY
32D-ZELLEN/SURVIVAL-ASSAY
BESTIMMUNG DER UEBERLEBENSRATE MITTELS PI-FAERBUNG
IMMUNFLUORESZENZFARBUNG
MOLEKULARBIOLOGISCHES ARBEITEN MIT PROTEINEN
GEWINNUNG VON PROTEINLYSATEN
4.4.2
4.4.2.1
4.4.2.2
4.4.2.3
4.4.2.4
4.4.2.5
4.4.2
.6
4.4.3
4.4.4
4.4.5
4.4.6
WESTERN-BLOT ANALYSE
VORBEREITUNG DER PROTEINPROBEN
AUFTRENNUNG VON PROTEINEN DURCH EINDIMENSIONALE
SDS-POLYACRYLAMID-GELELEKTROPHORESE (SDS-PAGE)
TRANSFER VON PROTEINEN AUF EINE NITROZELLULOSEMEMBRAN (BLOTTEN)
FAERBUNG DER PROTEINMEMBRAN MIT PONCEAUS
IMMUNDETEKTION VON PROTEINEN
ABLOESEN VON ANTIKOERPERN AUF EINER NITROZELLULOSEMEMBRAN (YYSTRIPPEN")
KINASE-ASSAY
BAKTERIELLE EXPRESSION UND AUFREINIGUNG REKOMBINANTER PROTEINE
BESTIMMUNG DER PROTEINKONZENTRATION
REPORTERGEN-ASSAY
62
62
63
64
65
65
66
66
68
69
69
5.
ERGEBNISSE
71
5.1
KLONIERUNG EINER KONSTITUTIV-AKTIVEN SAPK/JNK KINASE MUTANTE
71
5.2
DAS FUSIONSPROTEIN SAPKSS-MKK7 IST KONSTITUTIV-AKTIV UND ZEIGT
KEINE STIMULATION ENDOGENER SAPK/JNKS
73
5.3
SAPKSS-MKK7 FUEHRT ZUR PHOSPHORYLIERUNG DES
TRANSKRIPTIONSFAKTORS C-JUN
75
5.4
SAPKSS-MKK7 INDUZIERT DIE TRANSKRIPTIONEILE AKTIVITAET DER
TRANSKRIPTIONSFAKTOREN C-JUN UND ATF-2
78
5.5
DIE EXPRESSION VON SAPKSS-MKK7 BEEINFLUSST NICHT DIE AKTIVITAET
DER MAP KINASEN ERK1/2, P38 ODER ERK5/BMK1
80
5.6
INTRAZELLULAERE LOKALISATION VON SAPKSS-MKK
7
82
HERSTELLUNG EINER TETRAZYKLIN-INDUZIERBAREN NIH 3T3
FIBROBLASTENZELLLINIE, DIE SAPKSS-MKK
7
EXPRIMIERT
INDUZIERBARES SAPKSS-MKK7 PHOSPHORYLIERT C-JUN
IN SITU
LOKALISATION VON SAPKSS-MKK
7
IN DER NIH
3
T
3
TET-OFF
ZELLLINIE
5.10
KONSTITUTIV-AKTIVES SAPKSS-MKK7 INDUZIERT DIE MORPHOLOGISCHE
TRANSFORMATION VON NIH 3T3 ZELLEN UND FOERDERT DAS WACHSTUM
DIESER ZELLEN IN SOFT-AGAR
88
5.11
SAPKSS-MKK7 FUEHRT NUR ZU EINER SCHWACHEN STIMULATION EINES
AP-L/ETS-L-ABHAENGIGEN PROMOTORS
94
5.12
SAPKSS-MKK7 EXPRESSION VERURSACHT IN NIH 3T3 ZELLEN DIE
ZERSTOERUNG DES F-AKTIN ZYTOSKELETTS
95
5.13
ERFORDERT DIE DEGRADATION DES F-AKTIN ZYTOSKELETTS IN NIH
3
T
3
FIBROBLASTEN DIE NUKLEAERE LOKALISATION VON SAPKSS-MKK
7
?
98
5.14
KONSTITUTIV-AKTIVES SAPKSS INDUZIERT DIE TUMORBILDUNG IN VIVO
104
DIE EXPRESSION VON SAPKSS-MKK7 IN DER INDUZIERBAREN NIH
3
T
3
113
TET-OFF ZELLLINIE FUEHRT ZU EINER ERHOEHTEN PROLIFERATIONSRATE DER ZELLEN
SAPKSS-MKK7 UND SEINE ROLLE BEI DER STRESS-VERMITTELTEN INDUKTION 116
VON APOPTOSE
6. DISKUSSION
120
SAPKSS-MKK7 STELLT EINE SPEZIFISCHE UND KONSTITUTIV-AKTIVE MAP 120
KINASE DAR
6.2
SAPKSS-MKK7 ZEIGT BEVORZUGT EINE NUKLEAERE LOKALISATION
121
6.3
6.4
6.4.1
6.4.2
6.4
6.6
6.7
7.
ANHANG
AKTIVIERTES SAPKSS BESITZT EIN SEHR SCHWACHES POTENTIAL NIH 3T3
ZELLEN ZU TRANSFORMIEREN
WARUM HANDELT ES SICH BEI AKTIVIERTEM SAPKSS LEDIGLICH UM EINE
SCHWACH TRANSFORMIERENDE KINASE?
DIE EXPRESSION VON AKTIVIERTEM SAPKSS INDUZIERT GESTEIGERTE
PROLIFERATION VON NIH 3T3 FIBROBLASTEN
SAPKSS-MKK7 IST NICHT IN DER LAGE, DASS GEZIELTE UEBERLEBEN VON
TRANSFORMIERTEN ZELLEN ZU STIMULIEREN
SAPKSS-MKK7 UND SEINE FUNKTION BEI DER TUMORBILDUNG
IN VIVO
KONSTITUTIV-AKTIVES SAPKSS INDUZIERT DIE MORPHOLOGISCHE
TRANSFORMATION IN NIH 3T3 FIBROBLASTEN GEKOPPELT MIT DER
ZERSTOERUNG DES ZYTOSKELETTS
AUSBLICK
140
LITERATUR
141
ABKUERZUNGEN
DANKSAGUNG
LEBENSLAUF
VERZEICHNIS EIGENER PUBLIKATIONEN
ERKLAERUNG
162
162
166
167
169
170 |
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