Molekularbiologische Untersuchung der Strukturgene des aeroben N2-fixierenden Systems von Streptomyces thermoautotrophicus sowie funktionelle Charakterisierung von rekombinantem SdnO:
Gespeichert in:
| 1. Verfasser: | |
|---|---|
| Format: | Abschlussarbeit Buch |
| Sprache: | German |
| Veröffentlicht: |
2000
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INHALTSVERZEICHNISS
1
EINLEITUNG
1
1.1
GRUNDLAGEN
DER
BIOLOGISCHEN
STICKSTOFFIXIERUNG
1
1.1.1
DIE
BEDEUTUNG
DER
BIOLOGISCHEN
STICKSTOFFIXIERUNG
1
1.1.2
BIOCHEMIE
DER
BIOLOGISCHEN
STICKSTOFFIXIERUNG
2
1.1.3
ORGANISATION
UND
FUNKTION
DER
NIF-GENE
5
1.1.4
ALTERNATIVE
NITROGENASEN
5
1.2
DIE
AEROBE
STICKSTOFFIXIERUNG
IN
STREPTOMYCES
THERMOAUTOTROPHICUS
6
1
2.1
HABITAT
UND
CHARAKTERISIERUNG
VON
STREPTOMYCES
THERMOAUTOTROPHICUS
6
1.2.2
BIOCHEMIE
DER
AEROBEN
STICKSTOFFIXIERUNG
7
1.3
ZIELSETZUNG
11
2
MATERIAL
UND
METHODEN
12
2.1
BIOLOGISCHES
MATERIAL
12
2.1.1
BAKTERIENSTAEMME
12
2.1.2
PLASMIDE
13
2.1.3
OLIGONUKLEOTIDE
14
2.2
ANZUCHT
DER
BAKTERIENSTIMME
16
2.2.1
NAEHRMEDIEN
16
2.2.2
ANZUCHTBEDINGUNGEN
17
2.2.2.1
ANZUCHT
VON
STREPTOMYCES
THERMOAUTOTROPHICUS
17
2.2.2.2
ANZUCHT
VON
ESCHERICHIA
COLI
18
2.2.3
STAMMHALTUNG
18
2.3
ISOLIERUNG
VON
DNA
18
2.3.1
ISOLIERUNG
VON
GESAMT-DNA
AUS
STREPTOMYCES
THERMOAUTOTROPHICUS
18
2.3.2
ISOLIERUNG
VON
PLASMID-DNA
AUS
ESCHERICHIA
COLI
20
2.3.2.1
PLASMID-ISOLIERUNG
NACH
BIRMBOIM
UND
DOLY
20
2.3.2.2
PLASMID-ISOLIERUNG
MITTELS
ANIONENAUSTAUSCHCHROMATOGRAPHIE
20
2.3.2.3
PLASMID-ISOLIERUNG
MITTELS
QIAPREP
SPIN
PLASMID
KIT
22
2.4
REINIGUNG
VON
DNA
23
2.4.1
PHENOL-CHLOROFORM-EXTRAKTION
23
2.4.2
ISOPROPANOL-UND
ETHANOLPRAEZIPITATION
23
2.4.3
QIAQUICK
23
2.5
KONZENTRATIONSBESTIMMUNG
VON
DNA
24
2.6
AGAROSE-GELDEKTROPHORESE
24
2.6.1
ELUTION
VON
DNA-FRAGMENTEN
AUS
AGAROSE-GELEN
26
2.7
ENZYMATISCHE
BEHANDLUNG
VON
DNA
27
2.7.1
HYDROLYSE
DER
DNA
MIT
RESTRIKTIONSENDONUKLEASEN
27
2.7.2
DEPHOSPHORYLIERUNG
VON
VEKTOREN
28
2.7.3
LIGATION
VON
DNA-FRAGMENTEN
29
2.8
TRANSFORMATION
VON
DNA
29
2.8.1
HERSTELLUNG
KOMPETENTER
ZELLEN
29
2.8.2
TRANSFORMATION
VON
PLASMID-DNA
IN
KOMPETENTE
E.
CO/R-ZELLEN
30
2.9
POLYMERASE-KETTENREAKTION
30
2.10
SOUTHERN-TRANSFER
UND
DNA-HYBRIDISIERUNGSREAKTIONEN
32
2.10.1
HERSTELLUNG
DER
DIG-MARKIERTEN
HYBRIDISIERUNGSSONDEN
32
2.10.1.1
MARKIERUNG
VON
OLIGONUKLEOTIDEN
MIT
DIGOXIGENIN
11
-DDUTP
33
2
10.1.2
YYRANDOM
PRIMED
"
MARKIERUNG
VON
DNA-FRAGMENTEN
MIT
33
DIGOXIGENIN-DUTP
2.10.2
KOLONIE-HYBRIDISIERUNG
34
2.10.3
DOT-BLOT-HYBRIDISIERUNG
35
2.10.4
SOUTHERN-TRANSFER
35
2.10.5
HYBRIDISIERUNGS-UND
DETEKTIONSREAKTIONEN
36
2.11
DNA-SEQUENZIERUNG UND
AUSWERTUNG
DER
SEQUENZDATEN
38
2.12
UEBEREXPRESSION
EINES
REKOMBINANTEN
PROTEINS
IN
COLI
39
2.13
ANALYTISCHE
POLYACRYLAMID-GELELEKTROPHORESE
40
2.13.1
GELHERSTELLUNG
40
2.13.2
PROBENAUFTRAG
UND
DURCHFUEHRUNG
DER
ELEKTROPHORESE
41
2.13.3
UNSPEZIFISCHE
PROTEINFAERBUNG
MIT
COOMASSIE
BRILLIANT
BLUE
R
250
42
2.13.4
AKTIVITAETSFAERBUNG
VON
SUPEROXID-DISMUTASE
IM
NATIVEN
GEL
43
2.13.5
DENSITOMETRISCHE
AUSWERTUNG
VON
POLYACRYLAMIDGELEN
43
2.14
BESTIMMUNG
DER
N-TERMINALEN
AMINOSAEURESEQUENZ
43
2.14.1
VORBEHANDLUNG
DER
GELE
UND
PROBEN
44
2.14.2
WESTERN-BLOT
AUF
PVDF-MEMBRANEN
44
2.14.3
FAERBEN
UND
ENTFAERBEN
VON
PVDF-MEMBRANEN
45
2.15
HERSTELLUNG
VON
ZELLEXTRAKTEN
45
2.16
PROTEINBESTIMMUNG
46
2.16.1
PROTEINBESTIMMUNG
IN
GANZEN
ZELLEN
UND
IM
ROHEXTRAKT
46
2.16.2
PROTEINBESTIMMUNG
IN
ZELLFREIEN
EXTRAKTEN
46
2.17
AUFREINIGUNG
VON
REKOMBINANTEM
SDNO
47
2.17.1
ABTRENNUNG
VON
E.
COLI-EIGENEN
PROTEINEN
47
2.17.2
GELFIITRATION
AN
SEPHADEX
G-25
48
2.17.3
GELELUTION
VON
PROTEIN
AUS
NATIVEN
POLYACRYLAMIDGELEN
48
2.18
BESTIMMUNG DER
ENZYMAKTIVITAETEN
48
2.18.1
BESTIMMUNG
DER
REDUKTION
VON
NJ
ZU
AMMONIUM
48
2.18.2
BESTIMMUNG
DER
SOD-AKTIVITAET
50
2.18.3
BESTIMMUNG
DER
H2O2-BILDUNG
51
2.18.4
KONZENTRATIONSBESTIMMUNG
VON
^QRSTAMMLOESUNGEN
52
2.19
METALLANALYSE
DURCH
ATOMABSORPTION
53
2.20
ENZYME,
GASE
UND
CHEMIKALIEN
53
3
ERGEBNISSE
54
3.1
IDENTIFIZIERUNG
DER
STRUKTURGENE
DES
STL-PROTEINS
AUS
54
STREPTOMYCES
THERMOAUTOTROPHICUS
3.1.1
ABLEITUNG
DEGENERIERTER
OLIGONUKLEOTIDSONDEN
VON
DEN
N-TERMINI
DER
54
ST
1
-UNTEREINHEITEN
3.1.2
IDENTIFIZIERUNG
VON
DNA-FRAGMENTEN
DURCH
SOUTHERN
56
HYBRIDISIERUNGEN
MIT
DEN
OLIGONUKLEOTIDSONDEN
3.2
DIREKTE
KLONIERUNG
EINES
3,0
KB- SMAI-FRAGMENTS
AUS
59
GENOMISCHER
DNA
VON
STREPTOMYCES
THERMOAUTOTROPHICUS
3.3
IDENTIFIZIERUNG
UND
DIREKTE
KLONIERUNG
EINES
2,7
KB-SOCII
60
FRAGMENTS
AUS
GENOMISCHER
DNA
VON
STREPTOMYCES
THERMOAUTOTROPHICUS
3.4
NUKLEOTIDSEQUENZ
DER
SDN-STRUKTURGENE
DES
STL-PROTEINS
AUS
62
STREPTOMYCES
THERMOAUTOTROPHICUS
3.4.1
SEQUENZIERUNG
DER
SAEH-STRUKTURGENE
62
3.4.2
ANALYSE
DER
NUKLEOTIDSEQUENZ
DES
4,4
KB
GROSSEN
SMAL-SACTL
63
FRAGMENTS
3.4.2.1
ANALYSE
DES
STRUKTURGENS
SDNM
64
3.4.2.2
ANALYSE
DES
STRUKTURGENS
SDNS
68
3.4.2.3
ANALYSE
DES
STRUKTURGENS
SDNL
68
3.4.2.4
ZUSAMMENFASSENDE
ANALYSE
DES
4,4
KB
GROSSEN
FRAGMENTS
68
3.5
PRIMAERSEQUENZEN
DER
SDN-POLYPEPTIDE UND VERWANDTSCHAFT
ZU
72
ANDEREN
PROTEINEN
3.5.1
ANALYSE
DES
MITTLEREN
POLYPEPTIDS
SDNM
73
3.5.2
ANALYSE
DES
KLEINEN
POLYPEPTIDS
SDNS
76
3.5.3
ANALYSE
DES
GROSSEN
POLYPEPTIDS
SDNL
78
3.6
IDENTIFIZIERUNG
DES
STRUKTURGENS
DES
ST2-PROTEINS
AUS
STREPTOMYCES
THERMOAUTOIROPHICUS
82
3.6.1
ABLEITUNG
DEGENERIERTER
OLIGONUKLEOTIDE
VOM
N-TERMINUS
DER
ST2
UNTEREINHEIT
UND
VOM
C-TENNINUS
BEKANNTER
MANGAN-HALTIGER
SUPEROXID
DISMUTASEN
82
3.6.2
EINSATZ
DER
OLIGONUKLEOTIDE
ALS
DEGENERIERTE
PRIMER
IN
DER
PCR
83
3.6.3
IDENTIFIZIERUNG
VON
DNA-FRAGMENTEN
DURCH
SOUTHERN
HYBRIDISIERUNG
MIT
DEN
DEGENERIERTEN
OLIGONUKLEOTIDSONDEN
UND
MIT
DEM
PCR
AMPLIFIKAT
ALS
DNA-SONDE
84
3.7
KLONIERUNG
DES
PCR-AMPLIFIKATS
UND
ANALYSE
DER
NUKLEOTIDSEQUENZ
84
3.8
ANALYSE
DER
UMGEBUNG
VON
SDNO
88
3.8.1
ANALYSE
VON
ORFA
UND
DER
DAVON
ABGELEITETEN
AMINOSAEURESEQUENZ
93
3.8.2
ANALYSE
VON
ORFB
UND
DER
DAVON
ABGELEITETEN
AMINOSAEURESEQUENZ
93
3.8.3
ANALYSE
VON
ORJC
UND
DER
DAVON
ABGELEITETEN
AMINOSAEURESEQUENZ
95
3.8.4
ANALYSE
VON
ORFD
UND
DER
DAVON
ABGELEITETEN
AMINOSAEURESEQUENZ
96
3.8.5
ANALYSE
VON
ORFE
UND
DER
DAVON
ABGELEITETEN
AMINOSAEURESEQUENZ
98
3.8.6
ANALYSE
VON
YYORFP"
UND
DER
DAVON
ABGELEITETEN
AMINOSAEURESEQUENZ
100
3.8.7
ZUSAMMENFASSENDE
ANALYSE
DES
GESAMTEN
7
KB
GROSSEN
AEOTT
HI
FRAGMENTS
101
3.8.8
ZUSAMMENFASSENDE
ANALYSE
DER
PRIMAERSEQUENZEN
105
3.9
UEBEREXPRESSION
VON
SDNO
106
3.9.1
EINFUHREN
GEEIGNETER
SCHNITTSTELLEN
MITTELS
PCR
UND
KLONIERUNG
VON
SDNO
IN
DAS
PET-EXPRESSIONSSYSTEM
107
3.9.2
EXPRESSION
VON
AUTHENTISCHEM
SDNO
107
3.9.3
BESTIMMUNG
DER
N-TERMINALEN
SEQUENZ
DES
REKOMBINANTEN
SDNO
111
3.9.4
SUBZELLULAERE
LOKALISATION
VON
REKOMBINANTEM
SDNO
112
3.10
AUFREINIGUNG
VON
REKOMBINANTEM
SDNO
115
3.11
EIGENSCHAFTEN
DES
REKOMBINANTEN
SDNO
117
3.11.1
SOD-AKTIVITAET
117
3.11.2
AMMONIUMBILDUNGSAKTIVITAET
MIT
STL
120
3.11.3
BESTIMMUNG
DER
H
2
O
2
-BILDUNG
122
3.11.4
UNTEREINHEITENSTRUKTUR
UND
KOFAKTOREN
123
4
DISKUSSION
128
4.1
DIE
PRIMAERSEQUENZEN
CHARAKTERISIEREN
DAS
STL
PROTEIN
ALS
NEUES
128
MITGLIED
DER
MOLYBDAEN-HYDROXYLASE-SEQUENZFAMILIE
4.1.1
DAS
KLEINE
POLYPEPTID
SDNS
WIRD
ALS
FES-PROTEIN
IDENTIFIZIERT
137
4.1,2
DAS
MITTLERE
POLYPEPTID
SDNM
WIRD
ALS
MGATP-BINDENDES
PROTEIN
139
IDENTIFIZIERT
4.1.3
DAS
GROSSE
POLYPEPTID
SDNL
WIRD
ALS
MOLYBDAEN-KOFAKTOR-BINDENDES
143
PROTEIN
IDENTIFIZIERT
4.2
ZUSAMMENFASSENDE
GEGENFIBERSTELLUNG
DER
SEQUENZVORHERSAGEN
147
UND
DER
BIOCHEMISCHEN
ERGEBNISSE
4.3
SDNO
IST
DIE
SNPEROXID-OXIDOREDUKTASE
DES
NJ-FIXIERENDEN
154
SYSTEMS
4.4
DIE
AEROBE
STICKSTOFFIXIERUNG
IN
&
THERMOAUTOTROPKICUS
-
DIE
156
SEQUENZEN
GEBEN
EINE
ERKLAERUNG
4.5
DIE
AEROBE
STICKSTOFFIXIERUNG
IN
&
THERMOAUTOTROPKICUS
-
EINE
157
ENTGIFTUNGSREAKTION
?
4.6
MOEGLICHKEITEN
DER
PRAKTISCHEN
ANWENDUNG
UND
WEITERE
158
AUSSICHTEN
5
ZUSAMMENFASSUNG
160
6
SUMMARY
162
7
LITERATURVERZEICHNIS
164 |
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| author | Hofmann-Findeklee, Carla |
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