Die Expression des Hitzeschockgens htpG von Bacillus subtilis wird von einem essentiellen Zwei-Komponenten-System reguliert:
Gespeichert in:
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| Format: | Buch |
| Sprache: | German |
| Veröffentlicht: |
2000 [erschienen] 2001
|
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| Beschreibung: | Bayreuth, Univ., Diss., 2001 |
| Beschreibung: | VII, 162 S. Ill., graph. Darst. |
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INHALTSVERZEICHNIS
INHALTSVERZEICHNIS
A
ZUSAMMENFASSUNG
SEITE
1
SUMMARY
3
B
EINLEITUNG
4
I
DIE
HITZESCHOCKANTWORT
4
1.1
DIE
HITZESCHOCKPROTEINE
4
1.2
KLASSIFIZIERUNG
DER
HITZESCHOCKPROTEINE
5
1.2.1
DIE
HSP90-KLASSE
5
1.2.2
DIE
HSP70-KLASSE
6
1.2.3
DIE
HSP60-KLASSE
7
1.2.4
DIE
KLASSE
DER
KLEINEN
HSPS
8
2
DIE
REGULATION
DER
HITZESCHOCKANTWORT
BEI
EUBAKTERIEN
9
2.1
DIE
REGULATION
DER
HITZESCHOCKANTWORT
BEI
.
COLI
9
2.1.1
DAS
HTP-REGULON
10
2.1.2
DAS
HTR-REGULON
11
2.2
DIE
REGULATION
DER
HITZESCHOCKANTWORT
BEI
B.
SUBTILIS
12
2.2.1
KLASSE-I-HITZESCHOCKGENE
13
2.2.2
KLASSE-II-HITZESCHOCKGENE
13
2.2.3
KLASSE-III-HITZESCHOCKGENE
14
2.2.4
KLASSE-IV-HITZESCHOCKGENE
15
3
DAS
HTPG-GEN
15
3.1
REGULATION
DES
HTPG-GENS
BEI
B.
SUBTILIS
17
4
PROBLEMSTELLUNG
19
INHALTSVERZEICHNIS
SEITE
C
MATERIALIEN
UND
METHODEN
20
1
BAKTERIENSTAEMME,
PLASMIDE,
OLIGONUKLEOTIDE
UND
ANTIKOERPER
20
1.1
BAKTERIENSTAENUNE
20
1.2
PLASMIDE
24
1.3
OLIGONUKLEOTIDE
26
1.4
ANTIKOERPER
30
2
NAEHRMEDIEN,
PUFFER
UND
LOESUNGEN
30
2.1
NAEHRMEDIEN
31
2.2
ANTIBIOTIKALOESUNGEN
32
2.3
PUFFER
UND
LOESUNGEN
33
3
MATERIALIEN
UND
GERAETE
34
3.1
ENZYME
UND
PROTEINE
34
3.2
MOLEKULARGEWICHTSSTANDARDS
34
3.2.1
PROTEINSTANDARDS
34
3.2.2
DNA
UND
RNA-STANDARDS
34
3.3
BIOCHEMIKALIEN
UND
CHEMIKALIEN
35
3.4
RADIOCHEMIKALIEN
35
3.5
VERWENDETE
KITS
35
3.6
GERAETE
36
3.7
ZENTRIFUGEN
36
3.8
SONSTIGES
36
4
ALLGEMEINE
METHODEN
37
4.1
ABSORPTIONSMESSUNGEN
37
4.2
AUTORADIOGRAPHIE
37
4.3
MIKRODIALYSE
38
5
GENETISCHE
METHODEN
38
5.1
TRANSFORMATION
VON
ESCHERICHIA
COLI
38
5.1.1
STANDARDMETHODE
NACH
COHEN
ET
AL.
38
5.1.1.1
CACL
R
KOMPETENZBEHANDLUNG
VON
E.
COLI-ZELLEN
38
5.1.1.2
HERSTELLUNG
DAUERKOMPETENTER
E.
COLI-ZELLEN
39
5.1.1.3
TRANSFORMATION
39
II
INHALTSVERZEICHNIS
SEITE
5.1.2
TRANSFONNATION
MITTELS
ELEKTROPORATION
39
5.1.2.1
HERSTELLUNG
ELEKTROKOMPETENTER
ZELLEN
40
5.1.2.2
ELEKTROTRANSFORMATION
VON
PLASMID-DNA
40
5.2
TRANSFORMATION
VON
B.
SUBTILIS
41
5.2.1
HERSTELLUNG
KOMPETENTER
B.
SUBTILIS-ZELLEN
41
5.2.2
TRANSFORMATION
VON
PLASMID-DNA
41
5.3
ANLEGEN
VON
GLYCERIN-DAUERKULTUREN
43
5.4
AUFNEHMEN
VON
WACHSTUMSKURVEN
43
5.5
TRANSPOSONMUTAGENESE
43
6
BIOCHEMISCHE
METHODEN
44
6.1
METHODEN
ZUR
ISOLIERUNG
VON
PLASMID-DNA
AUS
ESCHERICHIA
COLI
44
6.1.1
ISOLIERUNG
VON
PLASMID-DNA
IM
KLEINEN
MASSSTAB
44
6.1.1.1
ISOLIERUNG
VON
PLASMID-DNA
NACH
HOLMES
UND
QUIGLEY
(BOILING
PREP)
44
6.1.1.2
ISOLIERUNG
VON
PLASMID-DNA
NACH
BIMBOIM
UND
DOLY
(ALKALISCHE
LYSE)
45
6.1.2
ISOLIERUNG
VON
PLASMID-DNA
IM
MITTLEREN
MASSSTAB
(MIDIPREP)
46
6.2
ISOLIERUNG
CHROMOSOMALER
DNA
46
6.3
REINIGUNG
UND
FAELLUNG
VON
DNA
47
6.3.1
PHENOLEXTRAKTION
48
6.3.2
ETHANOLFAELLUNG
48
6.3.3
REINIGUNG
MIT
DEM
PCR-PURIFICATION-KIT
48
6.4
ENZYMATISCHE
HYDROLYSE
VON
DNA
49
6.5
ELEKTROPHORESE
VON
DNA
IN
AGAROSEGELEN
49
6.6
EXTRAKTION
VON
DNA-FRAGMENTEN
AUS
AGAROSEGELEN
49
6.7
DEPHOSPHORYLIERUNG
LINEARISIERTER
DNA
MIT
ALKALISCHER
PHOSPHATASE
50
6.8
LIGATION
VON
DNA-FRAGMENTEN
50
6.9
HYBRIDISIERUNG
VON
EINZELSTRAENGIGEN
OLIGONUKLEOTIDEN
51
6.10
DNA-AMPLIFIZIERUNG
MITTELS
PCR
51
6.10.1
PCR-REAKTION
MIT
DER
DEEP-VENT
BZW.
TAQ-DNA-POLYMERASE
51
6.10.2
REINIGUNG
DES
AMPLIFIZIERTEN
PCR-PRODUKTES
52
IN
INHALTSVERZEICHNIS
IV
SEITE
7
ARBEITEN
MIT
RNA
52
7.1
DEPC-BEHANDLUNG
VON
LOESUNGEN
UND
GLASGERAETEN
52
7.2
PROBENENTNAHME
ZUR
RNA-PRAEPARATION
52
7.3
ISOLIERUNG
VON
GESAMT-RNA
AUS
BACILLUS
SUBTILIS
54
7.4
ELEKTROPHORESE
VON
RNA
IN
AGAROSEGELEN
55
7.5
TRANSFER
VON
RNA
AUF
NYLONMEMBRANEN
57
7.5.1
NORTHERN-BLOT
57
7.5.2
SLOT-BLOT
58
7.6
ZN-VIZRO-SYNTHESE
DIG-MARKIERTER
SSRNA-MOLEKUELE
59
7.7
REINIGUNG
VON
DIG-MARKIERTEN
SSRNA-SONDEN
MITTELS
PRAEABSORPTION
60
7.8
HYBRIDISIERUNG
MEMBRANGEBUNDENER
RNA
MIT
DIG-MARKIERTEN
61
SSRNA-SONDEN
7.9
NACHWEIS
DIG-MARKIERTER
NUKLEINSAEUREN
MITTELS
62
CHEMOLUMINESZENZ
7.10
DENSITOMETRISCHE
QUANTIFIZIERUNG
VON
SLOT-BLOT-ANALYSEN
63
8
ARBEITEN
MIT
PROTEINEN
63
8.1
GEWINNUNG
VON
NATIVEN
ZELLEXTRAKTEN
AUS
B.
SUBTILIS
63
8.2
BESTIMMUNG
DER
PROTEINKONZENTRATION
64
8.3
ELEKTROPHORESE
IN
DISKONTINUIERLICHEN
SDS-POLYACRYLAMID-GELEN
65
8.4
FAERBUNG
VON
PROTEINEN
IN
POLYACRYLAMID-GELEN
66
8.5
WESTEM-BLOT
67
8.6
IMMUNOLOGISCHER
NACHWEIS
MEMBRANGEBUNDENER
PROTEINE
67
8.6.1
NACHWEISREAKTION
DURCH
ALKALISCHE
PHOSPHATASE
68
8.6.2
NACHWEISREAKTION
DURCH
MEERRETTICH
PEROXIDASE
69
8.7
BESTIMMUNG
DER
SS-GALAKTOSIDASE-AKTIVITAET
NACH
HIRATA
69
8.8
INDUKTION
UND
UEBEREXPRESSION
REKOMBINANTER
PROTEINE
71
8.8.1
UEBERPRODUKTIONSTEST
DES
FUSIONSPROTEINS
71
8.8.2
UEBERPRODUKTION
DES
FUSIONSPROTEINS
71
8.9
NATIVE
REINIGUNG
VON
REKOMBINANTEM
HISTIDIN-FUSIONSPROTEIN
71
8.10
GELRETARDATIONSEXPERIMENTE
73
INHALTSVERZEICHNIS
SEITE
8.10.1
MARKIERUNG
DER
GELRETARDATIONSFRAGMENTE
73
8.10.2
GELRETARDATIONSANSATZ
74
8.10.3
NATIVE
POLYACRYLAMIDGELELEKTROPHORESE
(PAGE)
75
9
KONSTRUKTION
VON
PLASMIDEN
UND
STAEMMEN
75
9.1
KONSTRUKTION
VON
PLASMIDEN
75
9.1.1
KONSTRUKTION
VON
P^-,
P
(
,^
UND
PYY
C
-6GASS-PROMOTORFUSIONEN
76
9.1.2
KONSTRUKTION
DER
PROMOTORFUSION
PP
1WAPG
-BGAB
78
9.1.3
KONSTRUKTION
VON
PP
FAAI
-BGAB
78
9.1.4
KONSTRUKTION
VON
PAX-P^BGAB
78
9.2
KONSTRUKTION
VON
BAKTERIENSTAEMMEN
79
9.2.1
KONSTRUKTION
DER
STAEMME
B.
SUBTILIS
SV09
BIS
SV30
79
9.2.2
KONSTRUKTION
VON
B.
SUBTILIS
SV31
BIS
SV35
80
9.2.3
KONSTRUKTION
VON
B.
SUBTILIS
SV36
80
9.2.4
KONSTRUKTION
VON
B.
SUBTILIS
SV37
80
9.2.5
KONSTRUKTION
VON
B.
SUBTILIS
SV38
BIS
SV41
81
9.2.6
KONSTRUKTION
VON
B.
SUBTILIS
SV42
UND
B.
SUBTILIS
SV43
81
D
ERGEBNISSE
82
I
ANALYSE
DES
STREBINDUZIERTEN
VERHALTENS
VON
HTPG
82
I.I
DIE
HITZESCHOCKANTWORT
VON
HTPG
BEI
B.
SUBTILIS
WIRD
NICHT
DURCH
DENATURIERTE
PROTEINE
IM
CYTOPLASMA
INDUZIERT
82
2
IDENTIFIZIERUNG
DER
DNA-BINDESEQUENZ
DES
HTPG-GENS
VON
B.
SUBTILIS
84
2.1
DAS
HTPG-GEN
UNTERLIEGT
DER
KONTROLLE
EINES
AKTIVATORS
86
2.2
HYBRIDPROMOTOREN
SIND
HITZEINDUZIERBAR,
WENN
SIE
UEBER
DIE
HTPG
BINDESEQUENZ
VERFUGEN
88
2.3
NAEHERE
EINGRENZUNG
DER
LAGE
DER
A/PG-BINDESEQUENZ
BEI
B.
SUBTILIS
90
2.4
CHARAKTERISIERUNG
DER
DNA-BINDESEQUENZ
93
2.5
NORTHERN-BLOT-ANALYSE
VERSCHIEDENER
AETPG-PROMOTORFUSIONEN
95
2.5.1
DAS
HTPG-GM
WIRD
DURCH
EINEN
AKTIVATOR
REGULIERT
95
2.5.2
KARTIERUNG
DER
LAGE
UND
DER
SEQUENZ
DER
DNA-BINDESTELLE
96
V
INHALTSVERZEICHNIS
SEITE
2.5.3
NUKLEOTIDAUSTAUSCHE
IN
DNA-BINDESEQUENZ
VERHINDERN
DIE
AKTIVIERUNG
DES
AETPG-PROMOTORS
97
2.5.4
ANALYSE
DER
P^-PROMOTOREN
IM
NORTHEM-BLOT
97
3
DER
KARTIERTE
HTPG-PROMOTOR
IST
FOR
DIE
HITZESCHOCKANTWORT
VERANTWORTLICH
98
4
INTERAGIERT
DER
AKTIVATOR
DES
ZIRPG-GENS
MIT
DEM
VEGETATIVEN
A-FAKTOR?
100
4.1
SS-GALAKTOSIDASE-MESSUNG
DES
P
AC
-HYBRIDPROMOTORS
IM
STAMM
SV29
101
4.1
NORTHEM-BLOT-ANALYSE
DER
STAEMME
SV28
UND
SV29
102
5
GENETISCHER
ANSATZ
ZUR
IDENTIFIZIERUNG
DES
REGULATORGENS
VON
HTPG
IN
B.
SUBTILIS
103
6
DAS
HTPG-GEN
VON
B.
SUBTILIS
WIRD
DURCH
DAS
YYCFG-ZWEI
KOMPONENTEN-SYSTEM
REGULIERT
105
6.1
WESTEM-BLOT-ANALYSE
DES
STAMMES
SV38
107
6.2
NACHWEIS
DER
REGULATION
DES
HTPG-GENS
DURCH
DAS
YYCFG-ZWEI
KOMPONENTEN-SYSTEM
AUF
MRNA-EBENE
MITTELS
NORTHEM-BLOT
ANALYSEN
109
6.2.1
DIE
MENGE
DES
A/PG-MRNA-TRANSKRIPTS
KORRELLIERT
MIT
DER
IPTG
KONZENTRATION
109
6.2.2
DIE
HITZEINDUKTION
VON
HTPG
IST
IM
STAMM
SV38
IPTG-ABHAENGIG
HO
6.3
GELRETARDATIONS-ANALYSE
MIT
DEM
AETPG-PROMOTOR
UND
GEREINIGTEM
YYCF
112
6.4
YYCF
MUSS
STROMABWAERTS
DER-10-REGION
DES
ATPG-PROMOTORS
BINDEN,
UM
IHN
ZU
AKTIVIEREN
115
7
HITZESTRESS
IST
KEIN
GENERELLES
STIMULON
DES
YYCFG-ZWEI
KOMPONENTENSYSTEMS
117
8
MODULATION
DER
AKTIVITAET
DES
REGULATORPROTEINS
VON
HTPG
118
9
ANHANG
ZUM
ERGEBNISTEIL
120
VI
INHALTSVERZEICHNIS
SEITE
E
DISKUSSION
122
1
STRESSOREN
DER
INDUKTION
DES
ATPG-GENS
122
2
DER
REGULATIONSMECHANISMUS
VON
HTPG
IN
B.
SUBTILIS
123
2.1
DIE
EXPRESSION
DES
HTPG-GEN
ERFOLGT
DURCH
AKTIVIERUNG
DER
123
TRANSKRIPTION
2.2
DIE
VOM
TRANSKRIPTIONSAKTIVATOR
ERKANNTE
DNA-SEQUENZ
LIEGT
124
STROMABWAERTS
VOM
PROMOTOR
2.3
HTPG
WIRD
DURCH
EINE
CAABHAENGIGE
RNA-POLYMERASE
TRANSKRIBIERT
128
2.4
DIE
AKTIVIERUNG
VON
HTPG
ERFOLGT
DURCH
EIN
ESSENTIELLES
ZWEI
129
KOMPONENTEN-SYSTEM
2.5
DIE
TRANSKRIPTION
VON
HTPG
WIRD
DURCH
DAS
DNAK-CHAPERON
136
MODULIERT
3
ZUSAMMENFASSUNG
UND
AUSBLICK
136
F
ABKUERZUNGSVERZEICHNIS
140
G
LITERATURVERZEICHNIS
143
DANKSAGUNG
161
ERKLAERUNG
162
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