Untersuchungen zur stimulierten GTPase von EF-Tu aus Thermus thermophilus:
Gespeichert in:
1. Verfasser: | |
---|---|
Format: | Buch |
Sprache: | German |
Veröffentlicht: |
2002
|
Schlagworte: | |
Online-Zugang: | Inhaltsverzeichnis |
Beschreibung: | Bayreuth, Univ., Diss., 2002. - Auch als Online-Diss. mit der URL: http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:703-opus-82 |
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INHALTSVERZEICHNISS
I
INHALTSVERZEICHNISS
INHALTSVERZEICHNISS
.
I
ABKUERZUNGEN
.
VII
1
EINLEITUNG
.
1
1.1
DER
TRANSLATIONSZYKLUS
.
1
1.1.1
INITIATION
.
1
1.1.2
ELONGATION
.
2
1.1.3
TERMINATION
.
3
1.1.4
DIE
HYPOTHESE
DER
MOLEKULAREN
MIMIKRY
.
4
1.2
G-PROTEINE
.
5
1.2.1
DIE
ARGININFINGER-HYPOTHESE
DER
STIMULIERTEN
GTP-HYDROLYSE
.
7
1.3
DER
ELONGATIONSFAKTOR
TU
.
8
1.3.1
DIE
STRUKTUR
DES
EF-TU
.
9
1.3.2
NUKLEOTIDBINDUNG
UND
MG
2+
-KOORDINATION
.
10
1.3.3
WECHSELWIRKUNG
MIT
EF-TS
.
11
1.3.4
WECHSELWIRKUNG
MIT
AA-TRNA
.
13
1.3.5
WECHSELWIRKUNG
MIT
KIRROMYCIN
.
14
1.3.6
WECHSELWIRKUNG
MIT
RIBOSOM
.
15
1.4
DAS
RIBOSOMALE
PROTEIN
L12
.
18
1.5
ZIELSETZUNG
DER
ARBEIT
.
20
2
MATERIAL
UND
METHODEN
.
21
2.1
MATERIAL
.
21
2.1.1
GERAETE
.
21
2.1.2
MATERIALIEN
.
22
2.1.3
CHEMIKALIEN,
ENZYME
UND
PROTEINE
.
22
2.1.3.1
CHEMIKALIEN
.
22
2.1.3.2
ENZYME,
PROTEINE,
RIBOSOMEN
UND
TRNAS
.
22
2.1.3.3
KITS
.
23
2.1.3.4
RADIOCHEMIKALIEN
.
23
2.1.3.5
CHROMATOGRAPHIE-MATERIALIEN
.
23
2.1.4
PLASMIDE
.
23
2.1.5
OLIGODESOXYNUKLEOTIDE
.
24
2.1.6
BAKTERIENSTAEMME,
NAEHRMEDIEN
UND
LOESUNGEN
.
24
2.1.6.1
BAKTERIENSTAEMME
.
24
2.1.6.2
NAEHRMEDIEN
.
25
2.1.6.3
LOESUNGEN
.
25
INHAL
TSVERZEICHNISS
II
2.2
METHODEN
.
27
2.2.1
ABSORPTIONSMESSUNG
.
27
2.2.2
RADIOAKTIVITAETSMESSUNG
.
27
2.2.3
ZENTRIFUGATIONEN
.
28
2.2.4
ELEKTROSPRAYMASSENSPEKTROMETRIE
.
28
2.2.5
GELELEKTROPHORETISCHE
VERFAHREN
.
28
2.2.5.1
AGAROSE-GELELEKTROPHORESE
.
28
2.2.5.2
DENATURIERENDE
HAMSTOFF-POLYACRYLAMIDGELELEKTROPHORESE
.
29
2.2.5.3
SDS-POLYACRYLAMIDGELELEKTROPHORESE
.
29
2.2.5.4
POLYACRYLAMIDGELELEKTROPHORESE
UNTER
NATIVEN
BEDINGUNGEN
.
30
2.2.6
ELUTION
VON
TRNA
AUS
POLYACRYLAMIDGELEN
.
30
2.2.7
PHENOLEXTRAKTION
UND
ETHANOLFAELLUNG
VON
TRNA
.
31
2.2.8
ISOLIERUNG
UND
REINIGUNG
VON
DNA
.
31
2.2.8.1
PLASMIDPRAEPARATION
.
31
2.2.8.2
ELUTION
VON
DNA
AUS
AGAROSE-GELEN
.
32
2.2.9
ENZYMATISCHE
BEHANDLUNG
VON
DNA
.
32
2.2.9.1
HYDROLYSE
MIT
RESTRIKTIONSENDONUKLEASEN
.
32
2.2.9.2
LIGATION
.
32
2.2.10
POLYMERASEKETTENREAKTION
.
32
2.2.11
SEQUENZSPEZIFISCHE
MUTAGENESE
MIT
PCR
.
33
2.2.12
DNA-UEBERTRAGUNG
.
33
2.2.12.1
HERSTELLUNG
KOMPETENTER
ZELLEN
.
33
2.2.12.2
TRANSFORMATION
VON
E.
COLI
.
34
2.2.13
IMMUNODETEKTION
UND
SEQUENZIERUNG
VON
PROTEINEN
.
34
2.2.13.1
PROTEINTRANSFER
AUF
PDVF
ODER
NITROCELLULOSE-MEMBRANEN
.
34
2.2.13.2
IMMUNODETEKTION
.
35
2.2.13.3
PROTEINSEQUENZIERUNG
.
35
2.2.14
UEBERPRODUKTION
VON
T.
THERMOPHILUS
PROTEINEN
INE.
COLI
.
35
2.2.14.1
ZELLANZUCHT
UND
FERMENTATION
.
35
2.2.14.2
ANALYTISCHER
ZELLAUFSCHLUSS
.
36
2.2.14.3
ZELLAUFSCHLUSS
IM
PRAEPARATIVEN
MASSSTAB
.
36
2.2.15
ISOLIERUNG
VON
EF-TU
AUS
T.
THERMOPHILUS
.
37
2.2.15.1
ANIONENAUSTAUSCHCHROMATOGRAPHIE
UND
HITZEDENATURIERUNG
.
37
2.2.15.2
GELPERMEATIONSCHROMATOGRAPHIE
.
37
2.2.16
PRAEPARATION
VON
MG
2+
-
UND
NUKLEOTIDFREIEM
EF-TU
.
38
2.2.17
ISOLIERUNG
VON
EF-TU
C82A/L404C
UND
C82A/P357C
VARIANTEN
.
38
2.2.18
ISOLIERUNG
VON
T.
THERMOPHILUS
L12-R80A
.
38
2.2.19
GDP-BINDUNGSTESTS
.
40
2.2.19.1
NITROCELLULOSE-FILTERBINDUNGSTEST
ZUR
BESTIMMUNG
DER
SPEZIFISCHEN
AKTIVITAET
.
40
2.2.19.2
ASSOZIATIONSKINETIK
VON
EF-TU
UND
GDP
.
40
2.2.19.3
DISSOZIATIONSKINETIK
VON
GDP
AUS
EF-TU*GDP
.
40
2.2.19.4
GDP-AUSTAUSCH
IN
GEGEWART
VON
EF-TS
.
41
2.2.19.5
BESTIMMUNG
DER
DISSOZIATIONSKONSTANTEN
VON
EF-TU
UND
NUKLEOTID.
41
2.2.20
ISOLIERUNG
DES
TERNAEREN
KOMPLEXES
.
41
2.2.20.1
ISOLIERUNG
DES
TERNAEREN
KOMPLEXES
MIT
YYKALTEM
"
GTP
.
41
2.2.20.2
ISOLIERUNG
DES
TERNAEREN
KOMPLEXES
MIT
RADIAKTIVEM
[Y
32
P]
GTP
.
42
2.2.21
BESTIMMUNG
DER
GTPASE-AKTIVITAET
VON
EF-TU
.
42
2.2.21.1
INTRINSISCHE
GTPASE
.
43
2.2.21.2
RIBOSOMEN-STIMULIERTE
GTPASE
.
43
2.2.22
KINETIK
DER
IN
VITRO
TRANSLATION
.
43
INHALTSVERZEICHNISS
M
2.2.23
AUFREINIGUNG
VON
TRNA
PHE
AUS
E.
COLI
.
44
2.2.23.1
PRAEPARATION
VON
TRNABUIK
AUS
E.
COLI
DIO-ZELLEN
.
44
2.2.23.2
ANIONENAUSTAUSCHCHROMATOGRAPHIE
AN
DEAE-CELLULOSE
.
44
2.2.23.3 CHROMATOGRAPHIE
AN
BD-CELLULOSE
.
45
2.2.23.4
AUSSALZCHROMATOGRAPHIE
BEI
PH
4.5
.
45
2.2.23.5
AUSSALZCHROMATOGRAPHIE
BEI
PH
7.5
.
45
2.2.24
AMINOACYLIERUNG
VON
TRNA
.
46
2.2.24.1
PRAEPARATIVE
AMINOACYLIERUNG
VON
TRNA
.
46
2.2.24.2
ANALYTISCHE
AMINOACYLIERUNG
VON
TRNA
.
46
2.2.24.3
TESTEN
DER
FRAKTIONEN
BEI
DER
AUFREINIGUNG
VON
TRNA
PHE
AUS
E.
COLI.
47
2.2.25
AA-TRNA
HYDROLYSESCHUTZ-EXPERIMENTE
.
47
2.2.26
SYNTHESE
DER
GTP-ANALOGA
.
47
2.2.27
BESTIMMUNG
DER
BINDUNGSAFFINITAET
UND
DER
HYDROLYSEAKTIVITAET
VON
EF-TU
UND
DEN
GTP-ANALOGA
.
48
2.2.27.1
BINDUNGSAFFINITAET
UND
HYDROLYSEAKTIVITAET
VON
DABP-GTP
.
48
2.2.27.2
BINDUNGSAFFINITAET
UND
HYDROLYSEAKTIVITAET
VON
MAAP-GTP
.
49
2.2.27.3
PRODUKT
DER
EF-TU-KATALYSIERTEN
DABP-GTP
HYDROLYSE
.
50
2.2.28
REINIGUNG
VON
KIRROMYCIN
.
50
2.2.29
FLUORESZENZMARKIERUNG
VON
EF-TU
VARIANTEN
.
51
2.2.29.1
FLUORESZENZMARKIERUNG
VON
EF-TU
VARIANTEN
MIT
COUMARIN
MALEINIMID
(CPM)
.
51
2.2.29.2
FLUORESZENZMARKIERUNG
VON
EF-TU
MIT
1,5-IAEDANS
.
52
2.2.30
FLUORESZENZMARKIERUNG
VON
TRNA
.
52
2.2.30.1
FLUORESZENZMARKIERUNG
VON
TRNA
PHE
AUS
E.
COLI
MIT
FLUORESZEIN-
SUCCINIMIDESTER
(FAM-SE)
.
52
2.2.31
VORBEREITUNG
DER
T.
THERMOPHILUS
70S-L12-R80A
RIBOSOMEN
.
52
2.2.32
STOPPED-FLOW
EXPERIMENTE
MIT
MANT-DGTP
.
53
2.2.32.1
VORBEREITUNG
DER
RIBOSOMEN-KOMPLEXE
.
54
2.2.32.2
VORBEREITUNG
DES
TERNAEREN
KOMPLEXES
MIT
MANT-DGTP
.
54
2.2.32.3 DURCHFUEHRUNG
DER
STOPPED-FLOW
EXPERIMENTE
.
54
3
ERGEBNISSE
.
56
3.1
GTP-ANALOGA
.
56
3.1.1
SYNTHESE
UND
AUFREINIGUNG
VON
DABP-ANALOGA
.
56
3.1.2
SYNTHESE
UND
AUFREINIGUNG
VON
MAAP-GTP
.
60
3.2 DIE
GTP-ANALOGA
BINDEN
AN
EF-TUR.
.
62
3.2.1
BINDUNG
DER
DABP-ANALOGA
.
62
3.2.2 BINDUNG
DES
MAAP-GTP
.
64
33
HYDROLYSE
DER
GTP-ANALOGA.
.
65
3.3.1
HYDROLYSE
DES
MAAP-GTP
.
65
3.3.2 HYDROLYSE
DES
DABP-GTP
.
67
3.3.2.1
SPONTANE
DABP-GTP-HYDROLYSE
.
67
3.3.2.2
EF-TU-KATALYSIERTE
DABP-GTP-HYDROLYSE
.
69
3.3.2.3
PRIMAERER
ISOTOPENEFFEKT
AUF
DIE
DABP-GTP-HYDROLYSE
.
71
3.3.2.4
TEMPERATURABHAENGIGKEIT
DER
DABP-GTP-HYDROLYSE
.
72
INHALTSVERZEICHNISS
IV
3.3.2.5
DAS
PRODUKT
DER
DABP-GTP-HYDROLYSE
.
73
3.4
GTP-ANALOGA
BILDEN
EINEN
TERNAEREN
KOMPLEX
MIT
EF-TU
UND
AA-TRNA
74
3.5
DIE
VARIANTE
EF-TU
T62A
.
75
3.5.1
UEBEREXPRESSION
UND
REINIGUNG
VON
EF-TU
T62A
.
76
3.5.1.1
PRAEPARATION
VON
NUKLEOTIDFREIEM
EF-TUT
T62A
.
79
3.5.1.2
N-TENNINAIE
SEQUENZIERUNG
DES
60-405
FRAGMENTES
VON
EF-TUT
T62A.
79
3.5.2
CHARAKTERISIERUNG
DER
EF-TU
T62A
VARIANTE
.
80
3.6
FRET
ZUR
DETEKTION
DES
TERNAEREN
KOMPLEXES
.
84
3.6.1
UEBEREXPRESSION
UND
REINIGUNG
VON
EF-T
UM
.
C82A/L404C
UND
P357C
.
85
3.6.2
MODIFIKATION
DER
EF-TU
C82A/L404C
UND
P357C
VARIANTEN
.
86
3.6.3
MODIFIKATION
DER
EF-TU
VARIANTEN
MIT
COUMARIN-MALEINIMID
.
87
3.6.4
MODIFIKATION
DER
EF-TU
VARIANTEN
MIT
1,5-IAEDANS
.
89
3.6.5
CHARAKTERISIERUNG
DER
MODIFIZIERTEN
EF-TUR
C82A/L404C
UND
P357C
VARIANTEN
.
90
3.6.6
REINIGUNG
VON
E.
COLI
TRNA
PHE
.
94
3.6.7
MODIFIKATION
VON
E.
COLI
TRNA
1
*
1
"
MIT
FLUORESZEIN-SUCCINIMIDESTER
.
97
3.6.8
FLUORESZENZTITRATIONS
EXPERIMENTE
.
100
3.6.9
DISSOZIATION
DES
TERNAEREN
KOMPLEXES
.
102
3.7
UEBEREXPRESSION
UND
REINIGUNG
VON
T.
THERMOPHILUS
L12-R80A
.
103
3.8
VORBEREITUNG
DER
T.
THERMOPHILUS
70S-L12-R80A
RIBOSOMEN
.
106
3.9
UNTERSUCHUNGEN
ZUR
ARGININFMGER
HYPOTHESE
.
108
3.9.1
GTP-HYDROLYSE
AKTIVITAET
DER
ARGININ-MUTANTEN
VON
L12
UND
EF-TU
.
108
3.9.2
STOPPED-FLOW
MESSUNG
DER
AKTIVIERUNG
DER
GTPASE
.
111
4
DISKUSSION
.
115
4.1
SUBSTRAT-ASSISTIERTE
KATALYSE
DER
GTPASE
VON
EF-TU
AUS
T.
THERMOPHILUS
---------------------------------------------------------------------------
117
4.1.1
INTERAKTION
DER
GTP-ANALOGA
MIT
EF-TU
.117
4.1.2
DIE
SPONTANE
HYDROLYSE
DER
GTP-ANALOGA
.
119
4.1.3
DIE
EF-TU-KATALYSIERTE
HYDROLYSE
VON
DABP-GTP
.
121
4.2
FRET-ASSAY
ZUR
DETEKTION
DES
TERNAEREN
KOMPLEXES
.
125
4.3
UNTERSUCHUNGEN
ZUR
ARGININFMGER-HYPOTHESE
.
126
4.3.1
INTRINSISCHE
GTP-HYDROLYSE
DER
ARGININ-MUTANTEN
VON
EF-TU
.
126
4.3.2
RIBOSOMEN-STIMULIERTE
GTP-HYDROLYSE
.
127
4.3.2.1
AKTIVITAET
DER
EF-TU
MUTANTEN
.
127
4.3.2.2
AKTIVITAET
DER
RIBOSOMEN
MIT
L12-R80A
.
130
5
ZUSAMMENFASSUNG
.
135
INHALTSVERZEICHNISS
V
6
SUMMARY
.
137
7
LITERATUR
.139
8
ANHANG
.
151
8.1
VERGLEICH
DER
LIL
SEQUENZEN
.
151
8
J,
VERGLEICH
DER
L6
SEQUENZEN
.
152
8.3
VERGLEICH
DER
L6
SEQUENZEN
.
153
DANKSAGUNG
.154
ERKLAERUNG
.155 |
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