Funktionelle Charakterisierung des ORF3-Proteins des felinen Calicivirus:
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2002
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1.
EINLEITUNG
UND
SCHRIFTUM
7
1.1.
ALLGEMEINE
EINLEITUNG
7
1.2.
CALICIVIRIDAE
8
1.2.1.
MORPHOLOGIE
DER
CALICIVIREN
10
1.2.2.
GENOMORGANISATION
DER
CALICIVIREN
10
13.
DAS
FELINE
CALICIVIRUS
11
1.3.1.
MORPHOLOGIE
DES
FCV
11
1.3.2.
GENOMORGANISATION
DES
FCV
12
1.3.3.
REPLIKATION
DES
FCV
12
1.4.
BIOLOGIE
DES
ORF3
15
1.5.
VIRALE
RNA-VERPACKUNGSMECHANISMEN
15
1.6.
ARBEITSHYPOTHESE
17
1.7.
ARBEITSPLAN
17
2.
MATERIAL
UND
METHODEN
19
2.1.
VORWORT
19
2.2.
ZELLKULTURVERFAHREN
19
2.2.1.
KULTIVIERUNG
VON
CRFK-ZELLEN
19
2.2.2.
KULTIVIERUNG
VON
BSR-T7-ZELLEN
21
2.3.
VIRUS
22
2.3.1.
FELINES
CALICIVIRUS
22
2.3.2.
KULTIVIERUNG
DES
FELINEN
CALICIVIRUS
22
2.4.
KLASSISCHE
VIROLOGISCHE
VERFAHREN
23
2.4.1.
VIRUSTITRATION
23
2.4.2.
IMMUNFLUORESZENZ
24
2.4.3.
SERUMNEUTRALISATIONSTEST
26
2.5.
DNA-VERFAHREN
28
2.5.1.
PHENOL-CHLOROFORM-EXTRAKTION
UND
ETHANOL-PRAEZIPITATION
28
2.5.2.
RESTRIKTIONSENZYMVERDAU
VON
DNA
29
2.5.3.
AUFREINIGUNG
KLEINER
DNA-MENGEN
30
2.5.4.
DNA-GELELEKTROPHORESE
31
2.5.5.
EDV-GESTUETZTE
SEQUENZANALYSE
33
2.6.
VERFAHREN
ZUR
POLYMERASE-KETTENREAKTION
(PCR)
33
2.6.1.
SYNTHETISCHE
OLIGONUKLEOTIDE
33
2.6.2.
POLYMERASE-KETTENREAKTION
(PCR)
33
2.6.3.
REVERSE
TRANSKRIPTION
MIT
POLYMERASE-KETTENREAKTION
(RT-PCR)
35
2.7.
VERFAHREN
ZUR
KLONIERUNG
36
2.7.1.
KLONIERUNG
VON
DNA
IN
PLASMIDEN
ALLGEMEIN
36
2.7.2.
HERSTELLUNG
KOMPETENTER
BAKTERIEN
38
2.7.3.
PLASMIDLIGATION
40
2.7.4.
TRANSFORMATION
41
2.7.5.
PRAEPARATION
DER
PLASMID-DNA
AUS
KLEINEN
BAKTERIENPRAEPARATIONEN
43
(MINI-PREP)
2.7.6.
PRAEPARATION
DER
PLASMID-DNA
AUS
MITTLEREN
BAKTERIENPRAEPARATIONEN
45
(MIDI-PREP)
2.8.
RNA-VERFAHREN
47
2.8.1.
RNA-GELELEKTROPHORESE
47
2.8.2.
ISOLIERUNG
DER
GESAMT-RNA
AUS
EUKARYOTISCHEN
ZELLEN
49
2.8.3.
IN-VITRO-TRANSKRIPTION
OHNE
MARKIERUNG
50
2.8.4.
IN-VITRO-TRANSKRIPTION
MIT
DIGOXIGENIN-MARKIERUNG
52
2.8.5.
VAKUUM-BLOT
ZUM
TRANSFER
VON
RNA
AUF
EINE
NYLONMEMBRAN
54
2.8.6.
IMMUNOLOGISCHER
NACHWEIS
DIG-MARKIERTER
RNA
55
2.8.7.
RNA-PROTEIN-CO-IMMUNOPRAEZIPITATION
57
2.9.
VERFAHREN
ZUR
PROTEINEXPRESSION
60
2.9.1.
QIAEXPRESS-EXPRESSIONSSYSTEM
60
2.9.2.
TRANSFEKTION
EUKARYOTISCHER
ZELLEN
62
2.9.3.
MVA-T7
EXPRESSIONSSYSTEM
66
2.10.
VERFAHREN
ZUR
PROTEINANALYTIK
68
2.10.1.
DENATURIERENDE
PROTEINGELELEKTROPHORESE
(SDS-PAGE)
68
2.10.2.
WESTERN
BLOT
72
2.10.3.
HIS-TAG-GESTUETZTE
PROTEINREINIGUNG
75
2.10.4.
DIALYSE
VON
PROTEINEN
77
2.10.5.
PROTEIN-PROTEIN-CO-IMMUNOPRAEZIPITATION
77
2.11.
VERFAHREN
ZUR
HERSTELLUNG
POLYKLONALER
ANTIKOERPER
80
2.11.1.
ALLGEMEINES
PROTOKOLL
80
2.1
1
.2.
IMMUNISIERUNG
VON
KANINCHEN
8
1
4
2.11.3.
GEWINNUNG
VON
KANINCHENSEREN
81
3.
ERGEBNISSE
82
3.1.
PROKARYOTISCHE
EXPRESSION
VON
ORF3
82
3.1.1.
KLONIERUNG
VON
ORF3
IN
PQE30
82
3.1.2.
PROTEINEXPRESSION
83
3.1.3.
PROTEINAUFREINIGUNG
84
3.2.
OPTIMIERUNG
DES
MVA-T7-PROTEINEXPRESSION
SYSTEMS
85
33.
EUKARYOTISCHE
EXPRESSION
VON
ORF3
86
3.3.1.
KLONIERUNG
VON
ORSS
IN
PCDNA3.LMYC/HISA+
87
3.3.2.
PROTEINEXPRESSION
88
3.4.
EUKARYOTISCHE
EXPRESSION
VON
ORF2
89
3.4.1.
PLASMIDE
UND
ANTIKOERPER
FUER
DIE
EUKARYOTISCHE
EXPRESSION
89
VON
ORF2
3.4.2.
PROTEINEXPRESSION
90
3.5.
HERSTELLUNG
POLYKLONALER
ANTIKOERPER
GEGEN
ORF3
91
3.5.1.
HERSTELLUNG
DER
IMPFDOSIS
ZUR
IMMUNISIERUNG
VON
KANINCHEN
91
3.5.2.
IMMUNISIERUNG
VON
KANINCHEN
MIT
ORF3
91
3.5.3.
GEWINNUNG
VON
ANTI-ORF3-KANINCHENSEREN
92
3.5.4.
UNTERSUCHUNG
DER
ANTI-ORF3-KANINCHENSEREN
92
3.6.
UNTERSUCHUNG
DER
ORF3-EXPRESSION
IM
INFEKTIONSVERLAUF
93
3.7.
SERUMNEUTRALISATIONSTEST
MIT
ANTI-ORF3-ANTIKOERPERN
94
3.8. INDIREKTE
IMMUNFLUORESZENZ
GEGEN
DAS
ORF3
PROTEIN
95
3.9.
UNTERSUCHUNG
DER
INTERAKTION
VON
ORF2
UND
ORF3
96
3.10.
UNTERSUCHUNG
DER
INTERAKTION
VON
ORF3
UND
FCV-RNA
98
3.10.1.
KLONIERUNG
VON
FCV-GENOMABSCHNITTEN
IN
PGEM7ZF(+)
99
3.10.2.
IN-VITRO-TRANSKRIPTION
VON
FCV-GENOMABSCHNITTEN
MIT
100
NICHT-RADIOAKTIVER
MARKIERUNG
3.10.3.
IMMUNOPRAEZIPITATION
VON
ORF3-MYC/HIS
102
3.10.4.
CO-IMMUNOPRAEZIPITATION
VON
ORF3-MYC/HIS
UND
103
FCV-GENOMABSCHNITTEN
5
4.
DISKUSSION
104
4.1.
GRUNDLEGENDE
STRATEGIE
104
4.2.
HERSTELLUNG
VON
WERKZEUGEN
104
4.2.1.
PROKARYOTISCHE
EXPRESSION
VON
ORF3
104
4.2.2.
PROTEINAUFREINIGUNG
105
4.2.3.
OPTIMIERUNG
DES
MVA-T7-EXPRESSIONSSYSTEMS
105
4.2.4.
EUKARYOTISCHE
EXPRESSION
VON
ORF3
106
4.2.5.
EUKARYOTISCHE
EXPRESSION
VON
ORF2
107
4.2.6.
HERSTELLUNG
POLYKLONALER
ANTIKOERPER
GEGEN
ORF3
107
4.3.
CHARAKTERISIERUNG
VON
FCV-ORF3
108
4.3.1.
UNTERSUCHUNG
DER
ORF3-EXPRESSION
IM
INFEKTIONSVERLAUF
108
4.3.2.
SERUMNEUTRALISATIONSTEST
MIT
ANTI-ORF3-ANTIKOERPEM
108
4.3.3.
INDIREKTE
IMMUNFLUORESZENZ
GEGEN
DAS
ORF3-PROTEIN
109
4.3.4.
UNTERSUCHUNG
DER
INTERAKTION
VON
ORF2
UND
ORF3
HO
4.3.5.
UNTERSUCHUNG
DER
INTERAKTION
VON
ORF3
UND
FCV-RNA
111
4.4.
ABSCHLIESSENDE
BEWERTUNG
112
4.5.
AUSBLICK
112
5.
LITERATUR
113
6.
ZUSAMMENFASSUNG
118
7.
SUMMARY
119
8.
ANHANG
120
8.1.
VERWENDETE
ABKUERZUNGEN
120
8.2.
VERWENDETE
PRIMER
122
8.3.
ABBILDUNGSVERZEICHNIS
122
9.
LEBENSLAUF
123
10.
PRAESENTATIONEN
124
11.
DANKSAGUNG
125
6 |
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