CHLAMY 1, ein circadianes RNS-Bindeprotein aus Chlamydomonas reinhardtii: Isolierung, Klonierung der Gene und phylogenetische Analysen
Gespeichert in:
| 1. Verfasser: | |
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| Format: | Buch |
| Sprache: | German |
| Veröffentlicht: |
2002
|
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| Online-Zugang: | Inhaltsverzeichnis |
| Beschreibung: | München, Univ., Fak. für Biologie, Diss., 2002 |
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INHALTSVERZEICHNIS
1
EINLEITUNG
.
1
1.1
RHYTHMISCHE
VORGAENGE
IN
DER
BIOLOGIE
.
1
1.2
DIE
ELEMENTE
DES
CIRCADIANEN
SYSTEMS
.
4
1.2.1
DIE
LICHTWAHMEHMUNG
.
4
1.2.2
MOLEKULARE
GRUNDLAGEN
DES
SCHRITTMACHERS
.
5
1.2.3
DER
CIRCADIANE
AUSGANG
.
6
13
DAS
CIRCADIANE
SYSTEM
IN
C.
REINHARDTUE
.
8
1.4
MECHANISMEN
TRANSLATIONALER
REGULATION
.
10
1.5
AUFGABENSTELLUNG
.
12
2
MATERIAL
UND
METHODEN
.
13
2.1
MATERIAL
.
13
2.1.1
GERAETE
.
13
2.1.2
CHEMIKALIEN
.
14
2.1.3
ENZYME
.
14
2.1.4
KITS
UND
VERBRAUCHSMATERIALIEN
.
15
2.1.5
CHLAMYDOMONAS
REINHARDTU-STAEMME
.
15
2.1.6
NEUROSPORA
CRASSA-STAMM
.
16
2.1.7
VOLVOX
CARTERI-STIMME
.
16
2.1.8
ESCHERICHIA
COZI-STAEMME
.
16
2.1.9
VEKTOREN
.
16
2.1.10
PLASMIDE
.
17
2.1.11
DEGENERIERTE
OIIGONUKLEOTIDE
.
17
2.1.12
MOLEKULARMASSEN-STANDARDS
.
18
2.1.13
ANTISEREN
.
19
2.1.13.1
PRIMAERE
ANTISEREN
.
19
2.1.13.2
SEKUNDAERE
ANTIKOERPER
.
19
2.1.14
CDNS-BANK
.
20
2.1.15
KULTURMEDIEN
.
20
2.1.15.1
MEDIUM
ZUR
ANZUCHT
VON
C.
REINHARDTU
.
20
2.1.15.2
MEDIEN
ZUR
ANZUCHT
VON
BAKTERIEN
UND
PHAGEN
.
20
2.1.16
PUFFER
UND
LOESUNGEN
.
20
2.1.16.1
PUFFER
FUER
GELELEKTROPHORESE
UND
MOLEKULARBIOLOGISCHE
STANDARDMETHODEN
.
21
2.1.16.2
PUFFER
FUER
PROTEINCHEMISCHE
EXPERIMENTE
.
21
2.1.16.3
PUFFER
FUER
IMMUNOCHEMISCHE
EXPERIMENTE
.
22
2.1.16.4
PUFFER
FUER
HYBRIDISIERUNGS-EXPERIMENTE
.
22
2.2
METHODEN
.
23
2.2.1
ANZUCHT
VON
C.
REINHARDTUE
.
23
2.2.2
ERNTE
VON
C.
REMHARDTN
.
23
2.2.3
HERSTELLUNG
EINES
ROHEXTRAKTES
AUS
C.
REINHARDTUE
.
24
2.2.4
FRAKTIONIERENDE
AMMONIUMSULFAT-FAELLUNG
.
24
2.2.4.1
VERWENDUNG
EINER
AMMONIUMSULFAT-LOESUNG
.
24
2.2.4.2
VERWENDUNG
VON
FESTEM
AMMONIUMSULFAT
.
25
2.2.5
DIALYSE
VON
PROTEINLOESUNGEN
.
25
2.2.6
AUFKONZENTRIEREN
VON
PROTEINLOESUNGEN
.
26
2.2.7
BESTIMMUNG
DER
PROTEINKONZENTRATION
.
26
2.2.8
SPEZIFISCHE
RNS-AFFINITAETSCHROMATOGRAPBIE
.
26
2.2.9
WESTERN
BLOT
.
27
2.2.10
AUFTRAEGEN
VON
PEPTIDEN
AUF
MEMBRANEN
.
28
2.2.11
IMMUNODETEKTION
VON
PROTEINEN
.
28
2.2.11.1
NACHWEIS
MIT
MEERRETTICH-PEROXIDASE
.
29
2.2.11.2
NACHWEIS
MIT
ALKALISCHER
PHOSPHATASE
.
30
2.2.12
AFFINITAETSAUFREINIGUNG
VON
ANTIKOERPERN
.
30
2.2.12.1
KOPPLUNG
DES
PEPTIDS
AN
CNBR
AKTIVIERTE
SEPHAROSE
4B
.
30
2.2.12.2
KOPPLUNG
UND
ELUTION
DES
ANTIKOERPERS
.
,.31
2.2.13
POLYACRYLAMID-GELELEKTROPHORESE
(PAGE)
.
32
2.2.13.1
NATIVE
PAGE
.
32
2.2.13.2
DENATURIERENDE
PAGE
ZUR
AUFREINIGUNG
VON
TRANSKRIPTEN
.
33
2.2.13.3
DENATURIERENDE
PAGE
(SDS-PAGE)
ZUR
AUFTRENNUNG
VON
PROTEINGEMISCHEN
.
34
2.2.14
FAERBUNG
VON
PROTEINEN
NACH
PAGE
.
35
2.2.14.1
SILBERFAERBUNG
.
35
2.2.14.2
COOMASSIE-FAEFBUNG
.
35
2.2.15
IN
VIFRO-TRANSKRIPTION
.
36
2.2.15.1
TRANSKRIPTION
MIT
A
32
P-RUTP
.
36
2.2.15.2
TRANSKRIPTION
MIT
BIOTIN-14-CTP
.
37
2.2.15.3
HERSTELLUNG
EINES
NICHT-MARKIERTEN
TRANSKRIPTES
.
38
2.2.15.4
HERSTELLUNG
EINES
TRANSKRIPTES
MIT
YYCAP
"
-STRUKTUR
.
38
2.2.16
RADIOAKTIVE
MARKIERUNG
VON
SYNTHETISCHEN
OLIGONUKLEOTIDEN
.
39
2.2.17
YYMOBILITY
SHIFT
ASSAY
"
.
40
2.2.18
DICHTEGRADIENTEN-ZENTRIFUGATION
.
40
2.2.19
YYUV-CROSSLINKING
"
EXPERIMENT
.
41
2.2.20
DURCHMUSTERN
EINER
CDNS-BANK
AUS
C.
REINHARDTII
.
42
2.2.20.1
SICHTUNG
AUF
DNS-EBENE
.
42
2.2.20.2
SICHTUNG
AUF
PROTEINEBENE
.
42
2.2.20.3
IN
WVO-EXZISION
DES
PBLUESCRIPT
PHAGEMIDS
.
43
2.2.21
HYBRIDISIERUNG
EINER
CDNS-BANK
MIT
DEGENERIERTEN
OLIGONUKLEOTIDEN
.
44
2.2.22
POLYMERASEKETTENREAKTION
(PCR)
.
44
2.2.22.1
DESIGN
VON
DEGENERIERTEN
OLIGONUKLEOTIDEN
.
44
2.2.22.2
PCR
MIT
DEGENERIERTEN
OLIGONUKLEOTIDEN
.
45
2.2.23
IN
VITRO-TRANSLATION
.
45
2.2.24
AKTIVITAETSMESSUNG
DER
SS-GLUCURONIDASE
.
46
2.2.25
HERSTELLUNG
EINES
ROHEXTRAKTES
AUS
N.
CRASSA
.
47
2.2.26
HERSTELLUNG
EINES
ROHEXTRAKTES
AUS
V.
CARTERI
.
48
2.2.27
BIOCHEMISCHE
STANDARDMETHODEN
.
48
2.2.27.1
HERSTELLUNG
TRANSFORMATIONSKOMPETENTER
E.
COZI-ZELLEN
.
48
2.2.27.2
TRANSFORMATION
VON
E.
COLI
.
49
2.2.27.3
PLASMIDPRAEPARATION
AUSE.
COLI
.
49
2.2.27.4
QUANTIFIZIERUNG
VON
NUKLEINSAEUREN
.
50
2.2.27,5
RESTRIKTIONSVERDAU
.
50
2.2.27.5.1
ANALYTISCHER
RESTRIKTIONSVERDAU
.
50
2.2.27.5.2
PRAEPARATIVER
RESTRIKTIONSVERDAU
.
50
2.2.27.6
AUFTRENNUNG
VON
DNS
IM
AGAROSEGEL
.
51
2.2.27.7
ELUTION
VON
DNS-FRAGMENTEN
AUS
EINEM
AGAROSEGEL
.
51
2.2.27.8
GLAETTEN
VON
DNS-ENDEN
MIT
DEM
KLENOW-ENZYM
.
52
2.2.27.9
LIGATION
.
52
3
ERGEBNISSE
.
53
3.1
ANREICHERUNG
VON
CHLAMY
1
DURCH
EINE
AMMONIUMSULFAT-FAELLUNG
.
53
3.2
REGULATORISCHE
EIGENSCHAFTEN
VON
CHLAMY
1
.
56
3.2.1
KLONIERUNG
EINES
REPORTERKONSTRUKTES
.
56
3.2.2
EXPRESSION
UND
AKTIVITAETSMESSUNG
DER
SS-GLUCURONIDASE
.
59
3.3
BESTIMMUNG
DER
MOLEKULANNASSE
VON
CHLAMY
1
.
61
3.3.1
MOLEKULARMASSE
UNTER
NATIVEN
BEDINGUNGEN
.
62
3.3.1.1
ERSTELLUNG
EINER
EICHGERADE
ZUR
MOLEKULARMASSENBESTIMMUNG
DURCH
EINEN
DICHTEGRADIENTEN
.
62
3.3.1.2
BESTIMMUNG
DER
MOLEKULARMASSE
VON
CHLAMY
1
MITTELS
DICHTEGRADIENTEN-ZENTRIFUGATION
.
63
3.3.2
MOLEKULARMASSE
UNTER
DENATURIERENDEN
BEDINGUNGEN
.
64
3.4
AUFREINIGUNG
VON
CHLAMY
1
.
67
3.4.1
SPEZIFISCHE
RNS-AFFINITAETSCHROMATOGRAPHIE
.
68
3.4.1.1
BINDUNG
VON
CHLAMY
1
AN
EIN
BIOTINYLIERTES
TRANSKRIPT
.
68
3.4.1.2
CHLAMY
1
KANN
AN
EIN
IMMOBILISIERTES
BIOTIN-TRANSKRIPT
BINDEN
.
70
3.4.1.3
ELUTION
VON
CHLAMY
1
.
72
3.4.2
AUFREINIGUNG
VON
CHLAMY
1
IN
GROSSEM
MASSSTAB
.
74
3.5
PEPTLD-SEQUENZLERUNG
VON
CHLAMY
1
.
77
3.5.1
PEPTID-SEQUENZEN
VON
CHLAMY
1
.
78
3.5.2
AUSWERTUNG
DER
PEPTID-SEQUENZEN
VON
CHLAMY
1
.
79
3.6
VERSUCHE
ZUR
KLONIERUNG
DER
CHLAMY
/-GENE
UNTER
VERWENDUNG
VON
DEGENERIERTEN
OLIGONUKLEOTIDEN
.
81
3.7
SYNTHESE
UND
CHARAKTERISIERUNG
DER
PEPTID-ANTIKOERPER
GEGEN
DIE
UNTEREINHEITEN
VON
CHLAMY
1
.
82
3.7.1
UEBERPRUEFUNG
DER
SPEZIFITAET
DER
ANTIKOERPER
.
83
3.7.2
VERSUCHE
ZUR
AUFREINIGUNG
DER
ANTISEREN
AK1/2
UND
AK3
.
86
3.8
OSZILLATION
DER
CHLAMY
1
-MENGE
IN
EINEM
TAG-NACHT-ZYKLUS
.
88
3.8.1.1
SCHWANKUNG
DER
MENGE
VON
CHLAMY
1
-UNTEREINHEIT
CI
.
89
3.8.1.2
CIRCADIANE
SCHWANKUNG
IN
DER
MENGE
VON
CHLAMY
1-UNTEREINHEIT
C3
.
91
3.9
IDENTIFIZIERUNG
UND
ANALYSE
DER
CHLAMY
/-CDNS-SEQUENZEN
.
92
3.9.1
SICHTUNG
EINER
EXPRESSIONS-GENBANK
AUS
C.
REMHARDTII
MIT
PEPTID-ANTISEREN
.
92
3.9.2
SEQUENZANALYSE
DER
FUER
DIE
CHLAMY
1-UNTEREINHEITEN
CI
UND
C2
KODIERENDEN
CDNS-SEQUENZ
CHLAMY
1-C1/C2
UND
DES
PROTEINS
CHLAMY
1-C1/2
.
95
3.9.2.1
ANALYSE
DES
TEILKLONS
PCS30
.
95
3.9.2.2
COMPUTERGESTUETZTE
ANALYSE
VON
CHLAMY
1-C1/2
.
97
3.9.3
SEQUENZANALYSE
DER
FUER
DIE
CHLAMY
1
-UNTEREINHEIT
C3
KODIERENDEN
CDNS-SEQUENZ
CHLAMYL-C3
UND
DES
PROTEINS
CHLAMY
1-C3
.
102
3.9.3.1
ANALYSE
DES
KLONS
PCS3
1
.
102
3.9.3.2
COMPUTERGESTUETZTE
ANALYSE
VON
CHLAMY
1-C3
.
104
3.10
SUCHE
NACH
YYUG
"
-BINDEPROTEINEN
IN
ANDEREN
ORGANISMEN
.
108
3.10.1
UNTERSUCHUNGEN
AN
V.
CARTERI
.
108
3.10.1.1
BINDUNG
VON
CHLAMY
1
AN
REGA
AUS
V.
CARTERI
.
109
3.10.1.2
IDENTIFIZIERUNG
VON
RNS-BINDEPROTEINEN
IN
K
CARTERI
.
111
3.10.2
UNTERSUCHUNGEN
AN
N.
CRASSA
.
115
4
DISKUSSION
.
120
4.1
CHLAMY
1
ALS
REPRESSOR
DER
TRANSLATION
.
120
4.2
CHLAMY
1
IST
EIN
MULTIMER
.123
4.3
AUFREINIGUNG
UND
PEPTID-SEQUENZIERUNG
VON
CHLAMY
1
.
12S
4.4
PEPTID-ANTIKOERPER
GEGEN
DIE
UNTEREINHEITEN
VON
CHLAMY
1
.127
4.5
ABUNDANZ
DER
CHLAMY
1-UNTEREINHEITEN
CI
UND
C3
IN
EINEM
TAG-NACHT-ZYKLUS
.
129
4.6
IDENTIFIKATION
DER
CHLAMY
7-CDNS-SEQUENZEN
.
130
4.7
PROTEIN-DOMAENEN
DER
CHLAMY
1-UNTEREINHEITEN
.
133
4.8
RNS-BINDEPROTEINE
IN
V.
CARTERI
UND
N.
CRASSA
.
136
4.8.1
VOLVO
1
UND
VOLVO
2
IN
F.
CARTERI
.
136
4.8.2
CRASSA
1
UND
CRASSA
2
IN
N.
CRASSA
.
138
4.8.3
PHYLOGENETISCHE
KONSERVIERUNG
VON
YYUG
"
-BINDEPROTEINEN
.
140
4.9
AUSBLICK
_
140
5
ZUSAMMENFASSUNG
.
142
6
LITERATURVERZEICHNIS
.
144
7
VERZEICHNIS
DER
ABBILDUNGEN
UND
TABELLEN
.
156
8
ANHANG
.158
LEBENSLAUF.
.167
DANKSAGUNG.
.168 |
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