Quantifizierung intrahepatischer Zytokin-mRNA mittels reverser Transkription, kompetitiver und Echtzeit-Polymerasekettenreaktion im akuten Leberversagen:
Gespeichert in:
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Veröffentlicht: |
2002
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INHALTSVERZEICHNIS
I
I.
ABKUERZUNGSVERZEICHNIS
.
IV
1.
EINLEITUNG
.
1
1.1
MRNA-SEMIQUANTIFIZIERUNG
MITTELS
REVERSER
TRANSKRIPTION/POLYMERASEKETTEN
REAKTION
.
1
1.2
POLYMERASEKETTENRAKTION
(PCR)
.
1
1.3
REVERSE-TRANSKRIPTION/KOMPETITIVE
POLYMERASEKETTENREAKTION
.
4
1.4
ECHTZEIT-PCR
.
6
1.5
ZYTOKINE
.
9
1.5.1
INTERLEUKIN-1
.
10
1.5.2
INTERLEUKIN-10
.
11
1.5.3
INTERLEUKIN-12
.
11
1.5.4
INTERFERON-GAMMA
.
12
1.6
AKUTES
LEBERVERSAGEN
.
14
1.6.1
DEFINITION
.
14
1.6.2
AETIOLOGIE
.
15
1.6.3
HISTOLOGIE
.
18
1.6.4
KLINISCHE
PROBLEME
BEIM
AKUTEN
LEBERVERSAGEN
.
19
1.6.5
THERAPIE
DES
AKUTEN
LEBERVERSAGENS
.
20
1.7
CHRONISCHE
LEBERERKRANKUNGEN
.
22
1.7.1
DIE
CHRONISCHE
VIRUSHEPATITIS
.
22
1.7.2
LEBERZIRRHOSE
.
22
1.8
ZIELE
DER
ARBEIT
.
23
2.
MATERIAL
.
25
2.1
REAGENZIEN
FUER
DIE
RNA-EXTRAKTION
.
25
2.2
REAGENZIEN
FUER
DNASE-VERDAU
UND
REVERSE
TRANSKRIPTION
.
25
2.3
MATERIALIEN
FLIR
DIE
ECHTZEIT-PCR
.
25
2.4
MATERIALIEN
FUER
DIE
KOMPETITIVE
PCR
.
27
2.5
REAGENZIEN
FUER
DIE
SEPARATION
UND
STIMULATION
VON
PERIPHEREN
BLUTLYMPHOZYTEN
.
28
2.6
REAGENZIEN
FUER
DIE
AGAROSEGELELEKTROPHORESE
.
28
2.7
REINIGUNG
VON
PCR-PRODUKTEN
.
28
2.8
SONSTIGE
MATERIALIEN
.
.
28
2.9
GERFITE
.
29
2.10
UNTERSUCHTE
PATIENTENGRUPPEN
.
29
II
INHALTSVERZEICHNIS
3.
METHODEN
.
30
3.1
RNA-EXTRAKTION
.
30
3.2
NUKLEINSAEURE-KONZENTRATIONSBESTIMMUNG
.
-
-----
31
3.3
DNASE-VERDAU
.
32
3.4
REVERSE
TRANSKRIPTION
DER
RNA
IN
KOMPLEMENTAERE
DNA
.
33
3.5
KOMPETITIVE
RT-PCR
MIT
MULTISPEZILISCHEM
HETEROLOGEM
KOMPETITORFRAGMENT
ALS
INTERNER
STANDARD
.
34
3.5.1
DURCHFUEHRUNG
.
34
3.5.2
AUSWERTUNG
DER
KOMPETITIVEN
PCR
.
35
3.5.3
STATISTISCHE
AUSWERTUNG
.
35
3.6
ECHTZEIT-PCR
MIT
DEM
LIGHTCYCLER-SYSTEM
.
36
3.6.1
AUFBAU
UND
FUNKTIONSPRINZIP
.
36
3.6.2
DURCHFUEHRUNG
DER
ECHTZEIT-PCR
.
37
3.7
HEISSSTART-PCR
MIT
HILFE
VON
ANTIKOERPERN
.
39
3.8
AGAROSEGELELEKTROPHORESE
VON
DNA-MOLEKUELEN
UND
DEREN
UV-DETEKTION
.
40
3.9
REINIGUNG
VON
PCR-PRODUKTEN
.
41
3.10
ISOLIERUNG
UND
STIMULATION
VON
PERIPHEREN
BLUTLYMPHOZYTEN
.
42
3.10.1
FICOLLDICHTEZENTRIFUGATION
.
42
3.10.2
BESTIMMUNG
DER
ZELLKONZENTRATION
.
43
3.10.3
STIMULATION
VON
BLUTLYMPHOZYTEN
.
43
4.
ERGEBNISSE
.
44
4.1
OPTIMIERUNG
DER
ECHTZEIT-PCR
.
44
4.1.1
ANPASSUNG
VON
ETABLIERTEN
BLOCKZYKLERPROTOKOIIEN
AN
DAS
LIGHTCYCLER-SYSTEM
.
44
4.1.2
OPTIMIERUNG
VON
MESSTEMPERATUR,
MG
2
*
UND
PRIMERKONZENTRATION
.
50
4.2
QUANTIFIZIERUNG
BEI
DER
ECHTZEIT-PCR
.
51
4.3
UEBERPRUEFUNG
DER
PRODUKTE
MITTELS
AGAROSEGELELEKTROPHORESE
.
55
4.4
SEMI-QUANTIFIZIERUNG
VON
CDNA-PROBEN
AUS
HUMANEM
LEBERGEWEBE
MITTELS
ECHTZEIT-PCR/KOMPETITIVER
PCR
.
57
4.4.1
INTERLEUKIN-LSS
.
57
4.4.2
INTERFERON-?
.
62
4.4.3
INTERLEUKIN-10
.
67
4.4.4
INTERLEUKIN-12
P35
.
69
4.4.5
INTERIEUKIN-12
P40
.
71
4.5
VERGLEICH
DER
ZYTOKIN-MRNA-MENGEN
UNTEREINANDER
.
71
INHALTSVERZEICHNIS
III
5.
DISKUSSION
.
72
S.L
EINFUEHRUNG
.
72
S.2
DISKUSSION
DER
METHODE
.
73
5.2.1
PROBLEMATIK
DER
METHODE
.
73
5.2.2
ECHTZEIT-PCR
.
74
5.2.3
OPTIMIERUNG DER
PCR-BEDINGUNGEN
-
ANPASSUNG
VON
ETABLIERTEN
BLOCKZYKLERPROTOKOLLEN
AN
DAS
LIGHTCYCLER-SYSTEM
.
75
5.2.4
VERGLEICH
KOMPETITIVE
PCR
VS.
ECHTZEIT-PCR
.
76
5.3
DISKUSSION
DER
MESSERGEBNISSE
.
78
5.3.1
SEMIQUANTIFIZIERUNG
VON
CDNA-PROBEN
AUS
HUMANEM
LEBERGEWEBE
.
78
6.
ZUSAMMENFASSUNG
.
84
7.
LITERATUR
.85
8.
LEBENSLAUF.
.
95
9.
DANKSAGUNG
.
96 |
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