Molekulare, physiologische und biochemische Charakterisierung der Genfamilie für 4-Cumarat:Coenzym-A-Ligase aus Sojabohne (Glycine max L.):
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2002
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INHALTSVERZEICHNIS
I
INHALTSVERZEICHNIS
INHALTSVERZEICHNIS. I
ABKUERZUNGSVERZEICHNIS.V
VERZEICHNIS DER ABBILDUNGEN UND TABELLEN. VUE
1
EINLEITUNG
1
1.1 ALLGEMEINE PHYTOPATHOLOGIE. 1
1.2 DAS PATHOSYSTEM SOJABOHNE/P/RY
TOPHTHORA SOJAE.3
1.3 PHENYLPROPANSTOFFWECHSEL UND NACHFOLGENDE SYNTHESEWEGE.5
1.4 DIE 4-CUMARAT:COENZYM A LIGASE (4CL). 10
1.5
PROTEINSTRUKTURANALYSE.
.
7
.
15
1.6 ZIELSETZUNG DIESER ARBEIT.16
2 MATERIALIEN UND METHODEN. 17
2.1 MATERIALIEN. 17
2.1.1 CHEMIKALIEN UND SONSTIGE VERBRAUCHSMATERIALIEN. 17
2.1.2 GERAETE UND ZUBEHOER. 18
2.1.3 REAKTIONSSYSTEME UND KITS.18
2.1.4 ENZYME. 19
2.1.5 VEKTOREN.19
2.1.6 BAKTERIENSTAEMME.19
2.1.7 COMPUTERPROGRAMME.20
2.1.8 VERWENDETE PUFFERSYSTEME UND LOESUNGEN.21
2.1.9 VERWENDETE MEDIEN. 22
2.1.10 OLIGONUKLEOTIDE. 23
2.1.11 VERWENDETE ABGELEITETE AMINOSAEURESEQUENZEN.25
2.1.12 GENSPEZIFISCHE GM4CL-SONDEN FUER NORTHEM-HYBRIDISIERUNGEN.26
2.1.13 GENSPEZIFISCHE GM4CL-SONDEN FUER SOUTHEM-HYBRIDISIERUNGEN.26
2.1.14 VERWENDETE CDNA-PLASMIDE.27
2.1.15 PFLANZENMATERIAL.28
2.1.16 PHYTOPHTHORA-KULTUREN. 28
2.1.17 ELICITOR. 28
2.1.18 ANTIKOERPER. 28
2.2 METHODEN.28
2.2.1 PROTEINBESTIMMUNG. 28
2.2.2 STAMMHALTUNG DER ZELLSUSPENSIONSKULTUR VON SOJABOHNE
(GLYCINE MAX L.
CV. HAROSOY 63).29
2.2.3 STAMMHALTUNG VON PHYTOPHTHORA SOJAE.29
BIBLIOGRAFISCHE INFORMATIONEN
HTTP://D-NB.INFO/965378527
N
INHALTSVERZEICHNIS
2.2.4
2.2.5
2
.
2.6
2.2.7
2
.
2.8
2.2.9
2
.
2.10
2
.
2.11
2
.
2.12
2.2.13
2.2.14
2.2.15
2.2.16
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.
2.20
2
.
2.21
2
.
2.22
2
.
2
.
22.1
2
.
2
.
22.2
2.2.22.3
2.2.22.4
2.2.22.5
2.2.23
2.2.24
2.2.25
2.2.26
2.2.27
2.2.28
2.2.29
2.2.30
SDS-POLYACRYLAMID-GELELEKTROPHORESE (SDS-PAGE).29
PROTEINTRANSFER UND IMMUNODETEKTION . .30
AUFARBEITUNG VON SOJABOHNEZELLKULTUREN UND SOJABOHNEGEWEBEN.30
DIREKTER SPEKTRALPHOTOMETRISCHER ENZYMTEST. 30
BESTIMMUNG DER KM- UND VM-WERTE DER REKOMBINANTEN GM4CL-PROTEINE.31
ABSCHAETZUNG DER ENZYMAKTIVITAETEN VON GM4CLL, GM4CL2 UND GM4CL3/4
FUER 4-CUMARSAEURE AUS PROTEIN-ROHEXTRAKTEN.32
ELICITIERUNG VON SOJABOHNEZELLKULTUREN AUS KULTURSTADIUM I UND II.33
GEWINNUNG VON ZOOSPOREN VON PHYTOPHTHORA SOJAE.33
ANZUCHT VON SOJABOHNEKEIMLINGEN.33
INFEKTION VON SOJABOHNEKEIMLINGEN. 34
POLYMERASE-KETTEN-REAKTION (PCR). 34
LIGATIONSREAKTION. 35
ISOLIERUNG VON NUKLEINSAEUREN.35
ISOLIERUNG VON DNA-FAGMENTEN AUS AGAROSEGELEN.35
ISOLIERUNG VON PLASMIDEN AUS BAKTERIENZELLEN.36
ISOLIERUNG VON GENOMISCHER DNA.,.,36
ISOLIERUNG VON GESAMT-RNA.37
ISOLIERUNG VON POLY(A)+-RNA.37
GELELEKTROPHORETISCHE AUFTRENNUNG, TRANSFER UND NACHWEIS VON
NUKLEINSAEUREN . 38
GELELEKTROPHORETISCHE AUFTRENNUNG VON RNA.38
GELELEKTROPHORETISCHE AUFTRENNUNG VON DNA.38
TRANSFER VON NUKLEINSAEUREN. 38
UEBERTRAGUNG BAKTERIELLER NUKLEINSAEUREN AUF NITROCELLULOSEMEMBRAN.39
HERSTELLUNG RADIOAKTIV MARKIERTER DNA-SONDEN.*.39
HYBRIDISIERUNG MIT RADIOAKTIV MARKIERTEN DNA-SONDEN.40
DNA-SEQUENZIERUNG.40
PHYLOGENETISCHE ANALYSE.40
KLONIERUNG DER GM4CLL-CDNA. 41
ABLEITUNG VON DEGENERIERTEN OLIGONUKLEOTIDEN.,.41
AMPLIFIZIERUNG EINER GM4CLL-SONDE.43
HERSTELLUNG EINER CDNA-BANK. 44
DURCHMUSTEM EINER CDNA-BANK.45
SYNTHESE UND AMPLIFIKATION VON 5'-CDNA-ENDEN.45
ELIMINIERUNG DES STARTCODON DER GM4CLL UND GM4CLA UND LIGATION DER
MODIFIZIERTEN CDNA-SEQUENZEN IN DEN EXPRESSIONSVEKTOR PQE-30.46
KLONIERUNG DER GM4CL3 IN DEN EXPRESSIONSVEKTOR PQE-31.47
HERSTELLUNG ELEKTROKOMPETENTER BAKTERIENZELLEN.47
TRANSFORMATION VON PLASMIDEN IN BAKTERIENZELLEN.48
SYNTHESE VON REKOMBINANTEN PROTEINEN IN BAKTERIENZELLEN.48
ISOLIERUNG VON PROTEINEN AUS BAKTERIENZELLEN.49
METALLCHELAT-AFFINITAETSCHROMATOGRAPHIE.49
STRUKTURANALYSEN. 49
INHALTSVERZEICHNIS
III
2.2.30.1 STRUKTUR-VORHERSAGE. 49
2.2.30.2 HYBRID-BILDUNG. 50
2.2.30.3 /N-VIYRO-MUTAGENESE MIT PCR.52
3 ERGEBNISSE. 54
3.1 MOLEKULARE UND PHYSIOLOGISCHE CHARAKTERISIERUNG DER
GM4CL-ISOFORMEN.54
3.1.2 DAS EXPERIMENTELLE SYSTEM ZUR ISOLIERUNG DER GM4CLL -CDNA.54
3.1.3 KLONIERUNG EINES GM4CLL-FRAGMENTS. 54
3.1.4 ISOLIERUNG DER GM4CL 1 -CDNA.55
3.1.5 VERVOLLSTAENDIGUNG DER GM4CLL-CDNA.55
3.1.6 VERVOLLSTAENDIGUNG DER GM4CL4-CDNA. 56
3.1.7 SEQUENZVERGLEICHE DER 4CL-ISOFORMEN AUS SOJABOHNE UND ANDEREN
PFLANZEN.56
3.1.8 PHYLOGENETISCHE ANALYSE DER 4CL. 58
3.1.9 VERWANDTE GENE DER SOJABOHNE 4CL-ISOFORMEN IN ANDEREN
LEGUMINOSEN.59
3.1.10 GENOMISCHE ORGANISATION DER SOJABOHNE-4CLS.60
3.1.11 ORGANSPEZIFISCHE VERTEILUNG DER GM4CL-ISOFORMEN IN
SOJABOHNKEIMLINGEN.62
3.1.12 REGULATION DER GM4CL-ISOFORMEN NACH ELICITIERUNG VON
SOJABOHNEZELLKULTUREN.64
3.1.13 EXPRESSION DER GM4CL-ISOGENE IN SOJABOHNEKEIMWURZELN NACH
INFEKTION
MIT PHYTOPHTHORA SOJAE RASSE 1.67
3.2 BIOCHEMISCHE CHARAKTERISIERUNG DER GM4CL-ISOFORMEN.68
3.2.1 HETEROLOGE EXPRESSION DER GM4CL-CDNAS.68
3.2.2 KATALYTISCHE EIGENSCHAFTEN DER REKOMBINANTEN GM4CLL.70
3.2.3 KATALYTISCHE EIGENSCHAFTEN DER REKOMBINANTEN GM4CL4.70
3.2.4 VERVOLLSTAENDIGUNG DER KATALYTISCHEN DATEN DER REKOMBINANTEN GM4CL2
UND
3.2.5 IDENTIFIZIERUNG VON SEQUENZBEREICHEN, DIE DIE SUBSTRATSPEZIFITAET
DER 4CL
BESTIMMEN.72
3.2.6 PEPTIDMOTIVE INNERHALB DER SDR, DIE MOEGLICHERWEISE AN DER BINDUNG
DER
ZIMTSAEUREDERIVATE BETEILIGT SIND.,.75
3.2.7 YYALANINSCANNING"-MUTAGENESE ZWEIER MOEGLICHER SUBSTRATBINDEDOMAENEN
DER
GM4CLL.80
3.2.8 VALIN-DELETION IM MOTIV M6 VON GM4CL2 UND GM4CL3.82
4 DISKUSSION. 86
4.1 DIE GENFAMILIE DER 4-CUMARAT:COENZYM A LIGASE AUS SOJABOHNE.86
4.2 VERWANDTSCHAFTSVERHAELTNISSE DER 4CL.88
4.3 REGULATORISCHE FUNKTION DER 4CL. 89
4.4 MOEGLICHE PHYSIOLOGISCHE FUNKTIONEN DER 4CL-ISOFORMEN IN
SOJABOHNE.91
IV
INHALTSVERZEICHNIS
4.5
4.6
4.7
4.8
4.9
DIE SUBSTRATSPEZIFITAET DER 4CL WIRD DURCH DEN ZENTRALEN SEQUENZBEREICH
BESTIMMT. 94
DIE MOTIVE M4 UND M6 SIND MOEGLICHE SUBSTRATBINDEMOTIVE.95
VALIN-DELETION IM MOTIV M6 ERMOEGLICHT DEN SINAPINSAEURE-UMSATZ.98
WEITERE MOEGLICHE SUBSTRATBINDEMOTIVE. 101
AUSBLICK.102
5
ZUSAMMENFASSUNG
103
6
LITERATURVERZEICHNIS
105
7 ANHANG
117
AL
A2
A3
A4
A5
A6
A7
A8
ZUSAMMENSTELLUNG DER VERWENDETEN PCR-PROGRAMME. 117
NUKLEOTIDSEQUENZ DER GM4CLL-CDNA MIT ABGELEITETER AMINOSAEURESEQUENZ.'.
118
NUKLEOTIDSEQUENZ DER GM4CL4-CDNA MIT ABGELEITETER AMINOSAEURESEQUENZ.
120
VERGLEICH EINIGER 4CL-AMINOSAEURESEQUENZEN.122
ABHAENGIGKEIT DER REAKTIONSGESCHWINDIGKEIT DER GM4CL-ISOFORMEN VON DER
KONZENTRATION VERSCHIEDENER ZIMTSAEUREDERIVATE.124
VERGLEICH DER AMINOSAEURESEQUENZEN EINIGER 4CLS, PHEA UND LUCIFERASE.129
VERGLEICH VON AMINOSAEURESEQUENZEN EINIGER ADENYLAT-BINDENDER ENZYME.131
MUTATION IM GEICIRG-MOTIV. 133 |
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| title_full_unstemmed | Molekulare, physiologische und biochemische Charakterisierung der Genfamilie für 4-Cumarat:Coenzym-A-Ligase aus Sojabohne (Glycine max L.) vorgelegt von Christian Lindermayr |
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