cAMP-Bindung des Androgenrezeptors aus Stierskelettmuskel:
Gespeichert in:
| 1. Verfasser: | |
|---|---|
| Format: | Abschlussarbeit Buch |
| Sprache: | German |
| Veröffentlicht: |
2002
|
| Schlagworte: | |
| Online-Zugang: | Inhaltsverzeichnis |
| Beschreibung: | VI, 173 S. Ill., graph. Darst. : 21 cm |
Internformat
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INHALTSVERZEICHNIS
1
EINLEITUNG
.
1
1.1
H
ORMONE
.
1
1.2
S
TEROIDHORMONE
UND
IHRE
R
EZEPTOREN
.
1
1.3
P
ROTEIN
-
UND
P
EPTIDHORMONE
SOWIE
IHRE
E
FFEKTORSYSTEME
.4
1.4
"C
ROSS
-
TALK
"
DER
H
ORMONSIGNALWEGE
.
5
1.5
D
IE
T
RANSKRIPTIONSKOAKTIVATOREN
P
300
UND
CBP
.
6
1.6
D
IE
W
ECHSELWIRKUNG
ZWISCHEN
CBP/P300
UND
DEM
A
NDROGENREZEPTOR
.
7
1.7
P
ROBLEMSTELLUNG
.8
2
ABKUERZUNGEN
.
9
3
METHODEN
UND
MATERIALIEN
.
11
3.1
C
HEMIKALIEN
.
11
3.1.1
ALLGEMEINE
CHEMIKALIEN
.
11
3.1.2
ENZYME
.
13
3.1.3
PROTEINE
.
13
3.1.4
RADIOCHEMIKALIEN
.
13
3.1.5
SAEULENMATERIALIEN
.
13
3.1.6
AFFINITAETSHARZE
UND
-LIGANDEN
.
14
3.1.7
SONSTIGE
MATENALIEN
.
14
3.2
P
UFFER
UND
G
EBRAUCHSLOESUNGEN
.
16
3.2.1
PUFFER
.
16
3.2.2
LOESUNGEN
.
16
3.2.3
LOESUNGEN
VON
RADIOCHEMIKALIEN
.
18
3.2.4 LOESUNGEN
FUER
DIE
ELEKTROPHORESE
.
19
3.2.4.1
SDS-PAGE
ELEKTROPHORESE
.
19
S.2.4.2
FAERBELOESUNGEN
FUER
DIE
ELEKTROPHORESE
.
19
3.2.4.3
LOESUNGEN
FUER
WESTERN-BLOT
.
20
3.2.4.4
LOESUNG
FUER
AUTORADIOGRAPHIE
.
20
3.3
G
ERAETE
.
21
3.4
M
ETHODEN
.23
3.4.1
KONZENTRATIONSBESTIMMUNGEN
.
23
3.4
1.1
PROTEINBESTIMMUNG
NACH
BRADFORD
.
23
3.4.1.2
PHOSPHATBESTIMMUNG
NACH
(18)
.
24
3.4.2
CYTOSOLGEWINNUNG
AUS
STIEMACKENMUSKELN
.
26
3.4.3
UNTERSUCHUNGEN
ZUM
BINDUNGSVERHALTEN
DES
REZEPTORKOMPLEXES
.
27
3.4.3
1
BESTIMMUNG
DER
SPEZIFISCHEN
TESTOSTERONBINDUNG
.
27
3.4.3
2
BESTIMMUNG
DER
SPEZIFISCHEN
CAMP-BINDUNG
AN
FESTER
PHASE
.
29
3.4.3.3
BESTIMMUNG
DER
SPEZIFISCHEN
CAMP-BINDUNG
MIT
ZENTNFUGATIOENSSAEULCHEN
.
31
3.4.3.4
BESTIMMUNG
DER
CAMP-VERDRAENGUNG
DURCH
DEN
PHOTOLABEL
N
,
-(4-AZIDOSALICYTYT)-CAMP
.
32
INHALTSVERZEICHNIS
3.4.3.5
HYPERAKTIVIERUNFL
VON
CYTOSOL
(81)
.
33
3.4.3.6
HOCHSALZBEHANDLUNG
VON
CYTOSOL
.
34
3.4.3.7
AUSSALZUNG
MITTELS
AMMOMUMSULFAT:
.
34
3.4.3.B
PH-ABHAENGIGKEIT
DER
IMMOBILISIERTEN
CAMP-BLNDUNGSAKTIVITAET
.
35
3.4.3
9
AUSWIRKUNG
VON
K*.
NA*,
MFL
Z
*
UND
ADENOSINTNPHOSPHAT
(ATP)
AUF
DIE
BINDUNG
DES
ANDROGENREZEPTORKOMPLEXES
AN
1XAUA-HARZ
UND
DIE
RESULTIERENDE
IMMOBILISIERTE
CAMP-BINDUNGSAKTIVITAET37
3.4.3.10
AUSWIRKUNG
VON
MG
Z
*AUF
DIE
CAMP-BLNDUNGSAKTIVITAET
DES
IMMOBILISIERTEN
ANDROGENREZEPTORKOMPLEXES
.
38
3.4.4
CHROMATOGRAPHISCHE
METHODEN
.
39
3.4.4.1
GEIPERMEATIONSCHROMATOGRAPHIE
AN
SUPERDEX
200
.
39
3.4.4.2
HYDROPHOBE
INTERAKTIONSCHROMATOGRAPHIE
AN
PHENYLSEPHAROSE
.
40
3.4.4.3
HYDROPHOBE
INTERAKTIONSCHROMATOGRAPHIE
AN
BUTYLSEPHAROSE
.
44
3.4.4.4
IMMOBILISIERTE
METALLIONENCHROMATOGRAPHLE
(=
IMAC)
.
45
3.4.4.S
LONENAUSTAUSCHCHROMATOGRAPHIE
AN
CM-SEPHADEX
.
46
3.4.4.G
LONENAUSTAUSCHCHROMATOGRAPHIE
AN
Q-SEPHAROSE
.
46
3.4.4.7
AFFIMTAETSIONENAUSTAUSCHCHROMATOGRAPHIE
MITTELS
TRANSFORMATION
DES
ANDROGENHOLOREZEPTORS
AN
Q-SEPHAROSE
970922MO
(27)
.
47
3.4.4
8
CHROMATOGRAPHIE
AN
HYDROXYLAPATLT
.
47
3.4.4.9
AFFINITAETSCHROMATOGRAPHIE
AN
HEPANNSEPHAROSE
.
48
3.4.4.10
AFFINITAETSREINIGUNG
AN
CAMP-AGAROSE
.
49
3.4.4
11
AFFINITAETSREINIGUNG
MITTELS
BIOTINYLIERTER
TESTOSTERONDERIVATE
UND
BINDUNG
AN
AVIDIN
.
50
3.4.4.12
AFFINITAETSREINIGUNG
MITTELS
BIOTINYLIERTER
TESTOSTERONDERIVATE
UND
REVERSIBLER
BINDUNG
AN
BROMO
ODER
JODOAVIDIN
.
52
3.4.4.13
AFFINITAETSREINIGUNG
MITTELS
TESTOSTERON-HEXAHISTIDINDENVATE
UND
IMMOBILISIERTER
METALLIONENCHROMATOGRAPHLE
ZN(LL),
NI(LL),
FE(LLL)
UND
CU(LL)
.
54
3.4.5
ELEKTROPHORESEMETHODEN
.
55
3.4.5.1
DENATURIERENDE
DISKONTINUIERLICHE
SDS-PAGE
.
55
3.4.5.2
WESTEMBLOT
.
56
3.4.S.3
PRAEPARATIVE
ISOELEKTNSCHE
FOKUSSIERUNG
.
57
3.4.5.4
FAERBUNG
VON
PAGE-GELEN
.
58
3.4.5.5
AUTORADIOGRAPHIE
.
59
3.4.6
SYNTHESEN
UND
DERIVATISIERUNGEN
.
61
3.4.6.1
SYNTHESE
VON
AVIDINAFFINITAETSHARZEN
.
61
3.4.6.2
HERSTELLUNG
VON
JODOAVIDIN
.
62
3.4.6
3
HERSTELLUNG
VON
BROMOAVIDIN
.
63
3.4.6
4
SYNTHESE
DES
CAMP-PHOTOLABEL:
.
64
3.4.7
UNTERSUCHUNGEN
MIT
DEM
N
E
-(4-AZIDOSALICYLYL)-CYCLO-AMP
PHOTOLABEL
.
67
3.4.7.1
MARKIERUNG
DER
CAMP-BLNDENDEN
AKTIVITAET
DES
ANDROGENREZEPTORKOMPLEXES
MIT
DEM
TRITILERTEN
N
'
-
(4-AZIDOSALICYLYL)
[2,8
3
H]-CYCLO-AMP
PHOTOLABEL
.
67
3.4.7.2
STABILITAETSTEST
ZUR
UV-EMPFINDLICHKEIT
DES
N
'
-(4-AZIDOSALICYLYL)-CYCLO-AMP
PHOTOLABELS
.
68
4
ERGEBNISSE
.
69
4.1
E
IGENSCHAFTEN
DER
IMMOBILISIERTEN
T
ESTOSTERON
-
UND
C
AMP-B
INDUNGSAKTIVITAET
.69
II
INHALTEVERZEICHNIS
4.1.1
ZEITLICHE
STABILITAET
DER
IMMOBILISIERTEN
TESTOSTERON
UND
CAMP-BINDUNGSAKTIVITAETEN
.
69
4.1.2
PH-ABHAENGIGKEIT
DER
IMMOBILISIERTEN
CAMP-BINDUNGSAKTIVITAET
.
70
4.1.3
STABILITAET
DER
CAMP
BINDUNGSAKTIVITAET
UNTER
STRESSBEDINGUNGEN
.
70
4.1.4
EINFLUB
VON
MOLYBDAT
AUF
DIE
IMMOBILISIERTE
CAMP-BINDUNGSAKTIVITAET
.
71
4.1.5
AUSWIRKUNG
VON
IC,
NA*,
MFF*
UND
ADENOSINTRIPHOSPHAT
(A
TP)
AUF
DIE
BINDUNG
DES
ANDROGENREZEPTORKOMPLEXES
AN
1XAUA-TESTOSTERONHARZ
UND
DIE
RESULTIERENDE
IMMOBILISIERTE
CAMP-BINDUNGSAKTIVITAET.
.
72
4.1.6
EINFLUSS
VON
MAGNESIUMIONEN
AUF
DIE
IMMOBILISIERTE
CAMP-BINDUNGSAKTIVITAET
.
74
4.2
E
IGENSCHAFTEN
DER
NICHT
-
IMMOBILISIERTEN
T
ESTOSTERON
-
UND
C
AMP-B
INDUNGSAKTIVITAET
.
75
4.2.1
AUSSALZUNG
MITTELS
AMMONIUMSULFAT
.75
4.2.2
CAMP-BINDUNG
IN
FREIER
PHASE
.
76
4.2.3
PRAEPARATIVE
ISOELEKTRISCHE
FOKUSSIERUNG.
.78
4.2.4
MODULATOREN
DER
BINDUNGSAKTIVITAET
.80
4.2.4.1
ABTRENNUNG
HEMMENDER
FAKTOREN
MIT
SEPHADEX
G-50
.
80
4.2.4.2
HEMMUNG
DER
CAMP-BINDUNG
DURCH
MODULATORZUGABE
.
81
4.2.4.3
DER
EINFLUSS
VERSCHIEDENER
SALZKONZENTRATIONEN
AUF
DIE
TESTOSTERONBINDUNGSAKTIVITAET
.
82
4.2.4.4
HYPERAKTIVIERUNG
VON
CYTOSOL
.
84
4.3
C
HROMATOGRAPHISCHE
A
NSAETZE
ZUR
A
NREICHERUNG
DER
C
AMP-B
INDUNGSAKTIVITAET
.
85
4.3.1
GELPERMEATIONSCHROMATOGRAPHIE
AN
SUPERDEX200
.
85
4.3.2
HYDROPHOBE
INTERAKTIONSCHROMATOGRAPHIE
AN
PHENYLSEPHAROSE
.
87
4.3.2.1
PH-ABHAENGIGKEIT
DER
PROTEINBINDUNG
AN
PHENYLSEPHAROSE
.
88
4.3.2.2
SALZKONZENTRATIONSABHAENGIGKEIT
DER
PROTEINBINDUNG
AN
PHENYLSEPHAROSE
.
88
4.3.2.S
EINFLUSS
DES
SALZBEHANDLUNGSSCHRITTES
AUF
DIE
ANREICHERUNG
DER
CAMP-BINDUNGSAKTIVITAET
.
89
4.3.2.4
ENTFERNUNG
DES
CAMP-BINDUNGSINHIBITORS
MITTELS
HOCHSALZ
AN
PHENYLSEPHAROSE
.
91
4.3.3
HYDROPHOBE
INTERAKTIONSCHROMATOGRAPHIE
AN
BUTYLSEPHAROSE
.
92
4.3.4
KATIONENAUSTAUSCHCHROMATOGRAPHIE
AN
S-SEPHAROSE
UND
CM-SEPHADEX
.
94
4.3.5
ANIONENAUSTAUSCHCHROMATOGRAPHIE
AN
Q-SEPHAROSE
.
96
4.3.6
AFFINITAETSIONENAUSTAUSCHCHROMATOGRAPHIE
MITTELS
TRANSFORMATION
DES
ANDROGENHOLOEREZEPTORS
AN
Q-SEPHAROSE
.
98
4.3.7
CHROMATOGRAPHIE
AN
HYDROXYLAPATIT
.
99
4.3.8
IMMOBILISIERTE
METAILIONCHROMATOGRAPHIE
MIT
ZN(LL)-IONEN
.
100
4.3.9
PSEUDOAFFINITAETSCHROMATOGRAPHIE
AN
HEPARINSEPHAROSE
.
102
4.3.10
AFFINITAETSREINIGUNG
AN
CAMP-AGAROSE
.
104
AFFINITAETSREINIGUNG
AN
2
'
-0-VERKNUPFTE
CAMP-AGAROSE
.
104
4.3.10.2
AFFINITAETSREINIGUNG
AN
C
'
-VERKNUEPFTE
CAMP-AGAROSE
.
105
4.3.11
AFFINITAETSREINIGUNG
MITTELS
BIOTINYLIERTER
TESTOSTERONDERIVATE
UND
AVIDINBINDUNG
.
106
4.3.11.1
AVIDINAFFINITAETSREIMGUNG
MIT
'
N-(TESTOSTERONHEMISUCCINYL)
"
N-(BIOTINYL)-L-LYSIN
(THSBL)
.
107
4.3.11.2
AFFINITAETSMARKIERUNG/WESTERNBLOT
MIT
THSBLOME
UND
AVIDIN
.
108
4.3.12
AFFINITAETSCHROMATOGRAPHIE
MIT
DEM
BIOTINYLIERTEN
TESTOSTERONDERIVAT
THSBL
UND
JODOAVIDIN
.
109
III
INHALTSVERZEICHNIS
4.3.13
TESTOSTERONAFFINITAETSPHROMATOGRAPHIE
AN
MIT
ZR?*,
CRF*
ODER
FE
3
*
IONEN
BELADENEN
IMAC-MEDIEN
.
110
4.3.14
CAMP-BINDUNG
DES
AN
N^-IMAC
IMMOBILISIERTEN
ANDROGENREZEPTORS
.
114
4.4
M
ETHODENKOMBINATIONEN
.
116
4.4.1
KOMBINATION
VON
AUSSALZUNG
MITTELS
AMMONIUMSULFAT
UND
CHROMATOGRAPHIE
AN
PHENYLSEPHAROSE
.
116
4.4.2
KOMBINATION
VON
PHENYLSEPHAROSE
UND
NF'-IMAC
.117
4.4.3
KOMBINATION
VON
PHENYLSEPHAROSE-,
ANIONENAUSTAUSCH
UND
NI^-IMAC
.
119
4.4.4
KOMBINATION
VON
AFFINITAETSANIONENAUSTAUSCH
UND
TESTOSTERONAFFINITAETSCHROMATOGRAPHIE
AN
JODOAVIDIN
.
121
4.5
P
HOTOAFFINITAETSMARKIERUNG
DESC
AMP
BINDENDEN
A
NDROGENREZEPTORKOMPLEXES
.
123
4.5.1
SYNTHESE
DES
PHOTOLABELS
.
123
4.5.2
VERDRAENGUNG
DER
CAMP-BINDUNG
DURCH
DEN
CAMP-PHOTOLABEL
.
123
4.5.3
PHOTOSTABILITAET
DES
HF-(4-AZIDOSALICYL-)AMID
CAMP
PHOTOLABELS
.
125
4.5.4
PHOTOLABELLING
MIT
TF-(4-AZIDOSALICYL-)AMID
3
H-CAMP
.
126
5
DISKUSSION
.
128
5.1
E
IGENSCHAFTEN
DER
C
AMP
UND
T
ESTOSTERONBINDUNGSAKTIVITAET
DES
A
NDROGENREZEPTORKOMPLEXES
.
129
5.1.1
BINDUNGSART
DER
CAMP
UND
TESTOSTERONBINDUNG
.
129
5.1.2
REVERSIBILITAET
DER
BINDUNG
DES
ANDROGENREZEPTORS
AN
TESTOSTERONAFFINITAETSHARZE
.
130
5.1.3
ZEITLICHE
STABILITAET
DER
IMMOBILISIERTEN
TESTOSTERON
UND
CAMP-BLNDUNGSAKTIVITAETEN
.
131
5.1.4
IONISCHE
EINFLUESSE
AUF
DIE
IMMOBILISIERTE
CAMP-BINDUNGSAKTIVITAET
.
132
5.1.5
AUSWIRKUNG
VON
ADENOSINTRIPHOSPHAT
(ATP)
AUF
DIE
BINDUNG
DES
ANDROGENREZEPTORKOMPLEXES
.
133
5.2
E
IGENSCHAFTEN
DER
NICHTIMMOBILISIERTEN
C
AMP-B
INDUNGSAKTIVIT
A
T
.
134
5.2.1
PRAEPARATIVE
ISOELEKTRISCHE
FOKUSSIERUNG.
.
134
5.2.2
MODULATOREN
DER
BINDUNGSAKTIVITAET
.
135
5.3
C
HROMATOGRAPHISCHE
A
NREICHERUNG
DER
C
AMP-B
INDUNGSAKTIVITAET
.
137
5.3.1
GELPERMEATIONSCHROMATOGRAPHIE
.
137
5.3.2
HYDROPHOBE
INTERAKTIONSCHROMATOGRAPHIE
.
138
5.3.2.1
PH-ABHAENGIGKEIT
DER
ELUTION
.
138
S.3.2.2
EINFLUSS
DER
SALZKONZENTRATION
AUF
DIE
BINDUNG
UND
ELUTION
DES
ANDROGENREZEPTORKOMPLEXES
.
139
5.3.2.3
DER
EINFLUSS
DER
REZEPTORTRANSFORMATION
AUF
DIE
VERTEILUNG
.
140
5.3.3
LONENAUSTAUSCHCHROMATOGRAPHIE
.
141
5.3.3.1
KATIONENAUSTAUSCHCHROMATOGRAPHIE
.
141
5.3.3.2
ANIONENAUSTAUSCHCHROMATOGRAPHIE
UND
AFFINITAETSANIONENAUSTAUSCHCHROMATOGRAPHIE
.
142
5.3.4
PSEUDOAFFINITAETSCHROMATOGRAPHIE
AN
HEPARINSEPHAROSE
.
143
5.3.5
AFFINITAETSCHROMATOGRAPHIE
AN
CAMP-AGAROSE
.
144
5.3.6
AFFINITAETSREINIGUNG
MITTELS
BIOTINYLLERTEN
TESTOSTERONDERIVATEN
.
145
INHALTSVERZEICHNIS
5.3.7
TESTOSTERONAFFINITAETSCHROMATOGRAPHIE
AN
IMAC-MEDIEN
.
145
5.3.8
KOMBINATIONEN
VON
PROTEINREINIGUNGSMETHODEN
.
146
5.4
P
HOTOMARKIERUNG
DER
C
AMP-B
INDUNGSAKTIVITAET
.
147
5.5
.G
RAND
UNIFIEDTHEORY
"
DER
T
ESTOSTERONWIRKUNG
AN
M
USKELZELLEN
.
148
5.5.1
TESTOSTERON
UND
SHBG
.
148
5.5.2
TESTOSTERON
UND
DAS
MEMBRANSTAENDIGE
TESTOSTERONBINDUNGSPROTEIN
.
150
5.5.3
TESTOSTERON
UND
DER
ANDROGENREZEPTOR.
.
150
5.5.3.1
DIE
TRANSFORMATION
DES
ANDROGENREZEPTORS
.
150
5.5.3.Z
DER
ANDROGENREZEPTOR
UND
P300/CBP
.
153
6
ZUSAMMENFASSUNG
.
154
7
LITERATUR
.
155
8
VERZEICHNIS
DER
AKADEMISCHEN
LEHRER
.
172
9
LEBENSLAUF
.
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