Untersuchungen zur Rolle von reaktiven Sauerstoffspezies bei Ozon-induziertem Zelltod in Pflanzen:
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2002
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INHALTSVERZEICHNIS
INHALTSVERZEICHNIS
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[EINLEITUNG!
1. OZON.1
1.1. EIGENSCHAFTEN UND VORKOMMEN DES GASES.1
1.2. OZON ALS SCHADGAS BEI PFLANZEA.2
1.3. AUFNAHME UND REAKTIONEN VON OZON IN BLAETTERN.2
2. REAKTIVE SAUERSTOFFSPEZIES.5
2.1. ENTSTEHUNG UND DETOXIFIZIERTMG VON REAKTIVEN SAUERSTOFFSPEZIES.5
2.2. OZON-INDUZIERTER OXIDATIVER STRESS.8
2.3. ENZYMATISCHE BILDUNG VON REAKTIVEN SAUERSTOFFSPEZIES BEIM
YYOXIDATIVEN
BURST".10
2.4. ROLLE DER REAKTIVEN SAUERSTOFFSPEZIES ALS SIGNALMOLEKUELE UND BEI
PFLANZLICHEM
ZELLTOD.15
3. WEITERE SIGNALMOLEKUELE BEI DER INDUKTION PFLANZLICHER ABWEHR UND BEI
PROGRAMMIERTEM ZELLTOD.18
3.1. SALICYLSAEURE.18
3.2. ETHYLEN.,.21
3.3. JASMONSAEURE.23
3.4. STICKSTOFFMONOXID.24
4. THEMENSTELLUNG.26
N. MATERIAL UND METHODEN.27
1. GERAETE.27
2. CHEMIKALIEN.28
2.1. FEINCHEMIKALIEN UND ENZYME.28
2.2. MOLEKULARBIOLOGISCHE REAGENZIEN.28
3. PFLANZENMATERIAL.29
3.1. ART UND HERKUNFT DES PFLANZENMATERIALS.29
3.2. ANZUCHTBEDINGUNGEN.30
3.3. ERNTE.32
4. OZONBEHANDLUNG.V.32
4.1. OZONBEHANDLUNG IN DEN EXPOSITIONSKUEVETTEN.32
4.2. OZONEXPOSITION IM FREILAND.34
4.2.1 TABAK.34
4.2.2 EXPOSITION DER PFLANZEN IN OPEN-TOP KAMMERN.34
5. MESSUNG DER STOMATAEREN LEITFAEHIGKEIT.36
6. MESSUNG VON PARAMETERN DER ETHYLENBIOSYNTHESE.37
6.1. BESTIMMUNG DER ETHYLENEMISSION.37
6.2. BESTIMMUNG DES GEHALTS AN 1-AMINOCYCLOPROPAN-L-CARBONSAEURE.38
7. GEWINNUNG VON APOPLASTEN-FLUESSIGKEIT AUS TABAKBLAETTERN.39
8. NACHWEIS PHENOLISCHER INHALTSSTOFFE IN DER APOPLASTEN-FLUESSIGKEIT VON
TABAKBLAETTERN ALS HINWEIS AUF CYTOSOLISCHE VERUNREINIGUNG.40
9. POLYACRYLAMID-GELELEKTROPHORESE.43
9.1. AUFKONZENTRIERUNG VON PROBENEXTRAKTEN.43
9.2. PROTEINBESTIMMUNG NACH BRADFORD.43
9.3. AUFTRENNUNG VON PROTEINEXTRAKTEN MIT
POLYACRYLAMID-GELELEKTROPHORESE.43
9.3.1 SDS-GELELEKTROPHORESE.43
9.3.2 NATIVE POLYACRYLAMID-GELELEKTROPHORESE.45
10. AKTIVITAETSBESTIMMUNG VON OXALATOXIDASE.45
BIBLIOGRAFISCHE INFORMATIONEN
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INHALTSVERZEICHNIS
11. AKTIVITAETSBESTIMMUNG VON SUPEROXIDDISMUTASE.46
12. BESTIMMUNG DER GEHALTE AN SALICYLSAEURE.47
13. HISTOCHEMISCHE DETEKTION VON REAKTIVEN SAUERSTOFFVERBINDUNGEN.49
13.1. DETEKTION VON WASSERSTOFFPEROXID MITTELS
DIAMINOBENZIDIN-FAERBUNG.49
13.2. DETEKTION VON SUPEROXIDANION-RADIKALEN MIT HILFE DES FARBSTOFFS
NITROBLAUTETRAZOLIUM.50
14. HISTOCHEMISCHER NACHWEIS VON SS-GLUCURONIDASE AKTIVITAET.50
15. INFILTRATIONEN VERSCHIEDENER SUBSTANZEN IN DEN APOPLASTEN.51
16. BEHANDLUNG MIT PSEUDOMONAS SYRINGAE PV. SYRINGAE.52
17. BONITUR DER BLATTSCHAEDEN.52
18. MIKROSKOPIE.53
18.1. VERGLEICHENDE AUSZAEHLUNG DER STOMATA BEI BLAETTERN VON
M. SYLVESTRIS UND DER
TABAKSORTE BEL W3.53
18.2. HELLFELD- UND FLUORESZENZMIKROSKOPIE VON BLATTQUERSCHNITTEN.54
18.3. KONFOKALE LASER SCANNING MIKROSKOPIE.54
19. MOLEKULARBIOLOGISCHE METHODEN.55
19.1. HAEUFTG VERWENDETE MEDIEN, PUFFER-SYSTEME UND LOESUNGEN.55
19.2. STERILISATION UND RNASE-INHIBITIOO. 56
19.3. PRIMER.56
19.4. ISOLIERUNG VON NUKLEINSAEUREN.56
19.4.1 GESAMT-RNA.56
19.4.1.1 ISOLIERUNG NACH DER TRIZOL-METHODE.56
19.4.1.2 ISOLIERUNG NACH DER RNA-RAPID EXTRAKTIONSMETHODE.57
19.4.2 GENOMISCHE DNA.58
19.4.3 PLASMID DNA (QIAPREP SPIN).58
19.5. KONZENTRATIONSBESTIMMUNG VON NUKLEINSAEUREN.58
19.6. ELEKTROPHORETISCHE AUFTRENNUNG VON NUKLEINSAEUREN IN
NICHT-DENATURIERENDEN
AGAROSE-GELEN.59
19.7. NORTHERN ANALYSE.59
19.7.1 HERSTELLUNG VON SPEZIFISCHEN, MIT DIGOXIGENIN-DUTP MARKIERTEN
SONDEA.59
19.7.2 ELEKTROPHORETISCHE AUFTRENNUNG DER RNA IN DENATURIERENDEN
GELEN.60
19.7.3 NORTHERN BLOTTING.60
19.7.4 HYBRIDISIERUNG DER TRANSKRIPTE.61
19.7.5 DETEKTION DER TRANSKRIPTE.61
19.8. CDNA-SYNTHESE.62
19.9. QUANTIFIZIERUNG DER CDNA.62
19.10. POLYMERASE KETTENREAKTION (PCR).63
19.10.1 DESIGN DER PRIMER. 63
19.10.2 PCR-AMPLIFIKATION.1.63
19.10.3 QUANTIFIZIERUNG DER PCR-PRODUKTE.66
19.11. ELUTION VON DNA AUS AGAROSE GELEN.66
19.12. KLONIERUNG UND SEQUENZIERUNG VON PCR-PRODUKTEN.66
19.12.1 LIGATION.66
19.12.2 TRANSFORMATIOA.67
19.12.3 SEQUENZ-ANALYSEN.67
20. STATISTIK.67
JM.|
[ERGEBNISSE.68|
1. VERGLEICHENDE UNTERSUCHUNGEN ZUR OZONEMPFINDLICHKEIT DER TABAKSORTEN
BEL B UND BEL W3.68
1.1. CHARAKTERISIERUNG DER BLATTSCHAEDEN.68
INHALTSVERZEICHNIS
1.2. VERGLEICH DER ENTSTEHUNG VON BLATTSCHAEDEN MIT DER AKKUMULATION
REAKTIVER
SAUERSTOFFSPEZIES.70
1.3. OZONEXPOSITION VON TABAKPFLANZEN DER SORTE BEL W3 IM FREILAND.81
1.4. OZONBEHANDLUNG IN KAMMERVERSUCHEN UEBER MEHRERE TAGE HINWEG.83
1.5. ABHAENGIGKEIT DER AKKUMULATION VON REAKTIVEN SAUERSTOFFSPEZIES VOM
ABSTAND
ZUR OZONBEHANDLUNG.86
1.6. INDUKTION VERSCHIEDENER SIGNALMOLEKUELE AUSGELOEST DURCH
OZONEXPOSITION.87
2. CHARAKTERISIERUNG WEITERER NUTZ- UND WILDPFLANZEN BEZUEGLICH IHRER
OZON-
EMPFINDLICHKEIT .91
2.1. TOMATENPFLANZEN (LYCOPERSICON ESCULENTUM MILL.).91
2.1.1 AUSBILDUNG VON BLATTSCHAEDEN UND AKKUMULATION VON REAKTIVEN
SAUERSTOFFSPEZIES
NACH OZONEXPOSITION.91
2.1.2 BILDUNG DES PFLANZENHORMONS ETHYLEN BEI KONTROLL- UND
OZON-BEHANDELTEN
TOMATENPFLANZEN.95
2.2. ARABIDOPSIS THALIANA
L.96
2.2.1 ENTSTEHUNG VON BLATTSCHAEDEN UND AKKUMULATION VON REAKTIVEN
SAUERSTOFFSPEZIES
BEI KONTROLL- UND OZON-EXPONIERTEN PFLANZEN.97
2.2.2 OZON-INDUZIERTE EMISSION VON ETHYLEN BEI VERSCHIEDENEN
ARABIDOPSIS-
OEKTOYPEN.10$
2.3. MALVE
{MALVA SYLVESTRIS L. UND M. MOSCHATA L.).105
2.3.1 KORRELATION DER BLATTSCHAEDEN MIT DER AKKUMULATION REAKTIVER
SAUERSTOFF
SPEZIES .105
2.3.2 VERGLEICH DER OZON-INDUZIERTEN EMISSION VON ETHYLEN ZWISCHEN M.
MOSCHATA
UNDM
SYLVESTRIS.109
2.3.3 FREILANDVERSUCHE VON M. SYLVESTRIS UND ZWEI VERSCHIEDENEN
AMPFERARTEN.111
2.3.3.1 OZONINDUZIERTE BLATTSCHAEDEN UND AKKUMULATION VON REAKTIVEN
SAUERSTOFF
SPEZIES .111
2.3.3.2 INDUKTION DES GEHALTS DER ETHYLENVORSTUFE 1-AMINOC CLOPROPAN-1 -
CARBONSAEURE.113
2.4. MIKROSKOPISCHE UNTERSUCHUNGEN ZUR RAEUMLICHEN UND ZEITLICHEN
VERTEILUNG DER
AKKUMULATION REAKTIVER SAUERSTOFFVERBINDUNGEN BEI TABAK UND MALVE.115
2.4.1 MALVE.115
2.4.2 TABAK.'.117
2.5. HEMMUNG DES YYOXIDATIVEN BURSTS" DURCH INHIBITOREN VERSCHIEDENER
ENZYME .124
3. UNTERSUCHUNG MOEGLICHER AM YYOXIDATIVEN BURST" BETEILIGTER ENZYME IN
TABAK.127
3.1. POTENTIELLE BETEILIGUNG EINER OXALATOXIDASE AM OZON-INDUZIERTEN
YYOXIDATIVEN
BURST" IN NICOTIANA TABACUM L.127
3.1.1 UNTERSCHIEDE IM PROTEINMUSTER DER APOPLASTISCHEN FLUESSIGKEIT
ZWISCHEN PFLANZEN
DER TABAKSORTEN BEL B UND BEL W3.128
3.1.2 DETEKTION VON OXALATOXIDASE-AKTIVITAET IM APOPLASTEN VON TABAK.131
3.1.3 SUCHE NACH DEN GENEN FUER GERMIN-AEHNLICHE PROTEINE IN TABAK.135
3.2. BETEILIGUNG VON NADPH-OXIDASE HOMOLOGEN ENZYMEN UND
SUPEROXIDDISMUTASE
AN DER BILDUNG REAKTIVER SAUERSTOFFSPEZIES IN TABAK.136
3.2.1 IDENTIFIKATION UND CHARAKTERISIERUNG VON ZWEI ISOFORMEN DER
NADPH-OXIDASE IN
TABAK.136
3.2.2 NACHWEIS VON SUPEROXIDDISMUTASE-AKTIVITAET IN DER
APOPLASTENFLUESSIGKEIT VON
TABAK BEL B UND BEL W3.142
3.2.3 EXPRESSIONSSTUDIEN DER BEIDEN PUTATIVEN NADPH-OXIDASE ISOFORMEN IN
TABAK.144
3.2.3.1 EXPRESSION DER GENE
NTRBOH D UND F IN VERSCHIEDENEN GEWEBEN.144
INHALTSVERZEICHNIS
3.2.3.2 TRANSKRIPT-ANALYSE FUER
NTRBOH D
UND
F
WAEHREND UND NACH EINER OZON
BEHANDLUNG .147
3.2.3.3 INDUKTION DER GENEXPRESSION VON
NTRBOH D
UND
F
IN ABHAENGIGKEIT VON DER
OZONKONZENTRATION.156
3.2.3.4 EINFLUSS EINER INFEKTION DER TABAKSORTE BEL W3 MIT
PSEUDOMONAS SYRINGAE
PV.
SYRINGAE
AUF DIE EXPRESSION VON
NTRBOH D
UND
F
.158
3.2.3.5 INFILTRATION POTENTIELLER INDUKTOREN DER
NTRBOH D
UND
F
.161
WJJ
[DISKUSSION.,.163
1. KORRELATION DER AKKUMULATION REAKTIVER SAUERSTOFFSPEZIES MIT OZON
INDUZIERTEM ZELLTOD.163
1.1. AUFTRETEN VON SYMPTOMEN UND REAKTIVEN SAUERSTOFFSPEZIES IN
OZON-BEHANDELTEN
NUTZ- UND WILDPFLANZEN.163
1.2. ZELLULAERE LOKALISATION UND VERLAUF DER AKKUMULATION VON REAKTIVEN
SAUERSTOFFSPEZIES.168
1.3. AUFTRETEN VON OZON-INDUZIERTEN REAKTIVEN SAUERSTOFFSPEZIES UND
ZELLTOD IM
FREILAND.170
1.4. ZUSAMMENHANG VON REAKTIVEN SAUERSTOFFSPEZIES UND- ZELLTOD.171
2. WEITERE OZON-INDUZIERTE SIGNALMOLEKUELE SOWIE LOKALISATION
VERSCHIEDENER
STRESS-ANTWORTEN.173
2.1. ETHYLEN.173
2.2. SALICYLSAEURE.175
2.3. STICKSTOFFMONOXID.177
2.4. VERNETZUNG DER VERSCHIEDENEN, ZU OXIDATIVEM ZELLTOD- FUEHRENDEN
SIGNALWEGE .179
2.5. AUFTRETEN VON ABWEHRREKATIONEN UND SIGNALMOLEKUELEN ENTLANG DER
BLATTADEML81
3. POTENTIELLE ENZYME DES OZON-INDUZIERTEN YYOXIDATIVEN BURSTS".182
3.1. OXALATOXIDASE.183
3.2. NADPH-OXIDASE.185
3.2.1 ISOLIERUNG UND SEQUENZVERGLEICH MIT PUTATIVEN NADPH-OXIDASEN.185
3.2.2 EXPRESSIONSANALYSEN DER PUTATIVEN NADPH- OXIDASE HOMOLOGE
NTRBOH D
UND
F
IN TABAK.191
|VJ
[ZUSAMMENFASSUNG.200
|VL| [LITERATURVERZEICHNIS.203
VTL| [ANHANG.217
1. VERWENDETE PRIMER. 217
1.1. PRIMER FUER OXALATOXIDASE/GERMIN- AEHNLICHE PROTEINE.217
1.2. PRIMER FUER NADPH-OXIDASE.217
2. SEQUENZEN.219 |
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