Das komplexe Expressionsmuster von HLA-G und die Bedeutung seiner Genprodukte für die Funktion antigenunspezifischer Immuneffektorzellen:
Gespeichert in:
| 1. Verfasser: | |
|---|---|
| Format: | Buch |
| Sprache: | German |
| Veröffentlicht: |
2000
|
| Schlagworte: | |
| Online-Zugang: | Inhaltsverzeichnis |
| Beschreibung: | München, Univ., Fak. für Biologie, Diss., 2002 |
| Beschreibung: | V, 147 S. Ill., graph. Darst. |
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1
EINLEITUNG
.
1
1.1
MHC-MOLEKUELE
DER
KLASSEN
I
UND
II
.
1
1.1.1
STRUKTUR
DER
MHC-MOLEKUELE
.
2
1.1.1.1
MOLEKUELE
DER
KLASSE
II
.
2
1.1.1.2
MOLEKUELE
DER
KLASSE
1
.
3
1.1.1.3
MECHANISMEN
DER
MHC
KLASSE-L-RESTRINGIERTEN
ANTIGENPROZESSLERUNG
.
5
1.1.1.4
EINTEILUNG
DER
MOLEKUELE
DER
KLASSE
1
.
6
1.1.1.4.1
HLA-E
.
7
1.1.1.4.2
HLA-G:
GEMEINSAMKEITEN
UND
UNTERSCHIEDE
ZWISCHEN
HLA-G
UND
DEN
"KLASSISCHEN"
HLA-MOIEKUELEN
.
7
VERGLEICH
DER
GENORGANISATION
DER
KLASSE-IA-MOLEKUELE
UND
HLA-G
.
7
POLYMORPHISMUS
VON
HLA-G
.
9
UNTERSCHIEDE
IN
DER
REGULATION
DER
GENEXPRESSION
.
9
UNTERSCHIEDE
IN
DER
GENEXPRESSION
.10
EXPRESSION
VON
HLA-G
IN
DER
PLAZENTA
UND
VERMUTETE
FUNKTION
.
11
1.2
CYTOTOXISCHE
EFFEKTORZELLEN
.
13
1.2.1
NK-ZELLEN
IM
HUMANEN
UTERUS
.
13
1.2.2
DIE
FUNKTION
VON
NK-ZELLEN
.
14
1.2.2.1
DIE
FUNKTION
VON
MHC-KLASSE-I-MOLEKUELEN
BEI
DER
REGULATION
VON
NK-ZELLEN
.14
1.2.2.2
REZEPTOREN
DER
IMMUNGLOBULIN-SUPERFAMILE:
KIR
(KILLER
INHIBITORY
RECEPTORS)
.16
1.2.2.3
REZEPTOREN
DER
C-TYP
LECTIN-SUPERFAMILIE:
CD94/
NKG2
.
18
1.2.2.4
EINE
NEUE
GRUPPE
VON
REZEPTOREN
MIT
KLASSE-I-MOLEKUELEN
ALS
LIGANDEN
.19
2
ZIELSETZUNG
DER
ARBEIT
.
20
1)
UNTERSUCHUNGEN
ZUR
EXPRESSION
UND
REGULATION
VON
HLA-G
UND
DEN
HLA-G
ISOFORMEN
.
2)
HERSTELLUNG
EINES
KANINCHENANTISERUMS
UND
EINES
MONOKLONALEN
ANTIKOERPERS
.
3)
ETABLIERUNG
VON
TRANSFEKTANTEN
DER
HLA-G-ISOFORMEN,
CHARAKTERISIERUNG
UND
FUNKTIONELLE
UNTERSUCHUNGEN
.
3
MATERIAL
.
21
3.1
ABKUERZUNGEN.
.
21
3.2
CHEMIKALIEN
UND
ENZYME
.
23
3.3
ALLGEMEINE
PUFFER
UND
LOESUNGEN
.
23
3.4
BIOPSIE-MATERIAL
.
23
3.5
ANTIKOERPER
.
24
3.5.1
PRIMAERE
ANTIKOERPER
.
24
3.5.2
SEKUNDAERE
ANTIKOERPER
.
24
3.6
BAKTERIENSTAEMME
.
25
3.6.1
BAKTERIEN
FUER
DIE
SUBKLONIERUNG
.
25
3.6.2
BAKTERIEN
FUER
DIE
EXPRESSION
REKOMBINANTER
PROTEINE
.
25
3.7
EUKARYONTISCHE
ZELLEN
UND
TRANSFEKTANTEN
.
26
3.7.1
ZELLEN
.
26
3.7.2
TRANSFEKTANTEN
.
27
I
NHALTSVER
ZEICHN
IS
_
U
3.8
OLIGONUKLEOTIDE
.
27
3.9
VEKTOREN,
PLASMIDE,
SONDEN,
PEPTIDE,
PROTEINE
.
28
3.9.1
VEKTOREN
FUER
DIE
SUBKLONIERUNG
VON
PCR-PRODUKTEN
.
28
3.9.2
VEKTOREN
FUER
DIE
EXPRESSIONSKLONIERUNG
IN
BAKTERIEN
.
29
3.9.3
VEKTOREN
FUER
DIE
EXPRESSION
IN
EUKARYONTEN
.
29
3.9.4
PLASMIDE
.
29
3.9.4.1
HLA-G-ISOFORMEN
IN
PCRYYLL
.
29
3.9.4.2
KONSTRUKTE
FUER
DIE
EXPRESSION
DER
HLA-G
A1-DOMAENE
ALS
REKOMBINANTES
PROTEIN
IN
BAKTERIEN
.
29
3.9.4.3
HERSTELLUNG
DER
CDNA-KONSTRUKTE
FUER
DIE
TRANSFEKTION
DER
HLA-G-ISOFORMEN
IN
721.221
UND
K-562
.
30
3.9.5
SONDEN
.
31
3.9.5.1
SPEZIFISCHE
SONDE
FUER
HLA-B
.
31
3.9.5.2
SONDEN
FUER
HLA-G
.
31
3.9.6
PEPTIDE
.
32
3.9.7
PROTEINE
.
32
4
METHODEN
.
33
4.1
ARBEITEN
MIT
NUKLEINSAEUREN
.
33
4.1.1
REINIGUNG
UND
KONZENTRATION
VON
NUKLEINSAEUREN
.
33
4.1.1.1
PHENOLEXTRAKTION
.
33
4.1.1.2
PRAEZIPITATION
VON
NUKLEINSAEUREN
.
33
4.1.1.3
KONZENTRATIONSBESTIMMUNG
VON
NUKLEINSAEUREN
.
33
4.1.2
ISOLIERUNG
VON
NUKLEINSAEUREN
.
34
4.1.2.1
ISOLIERUNG
GENOMISCHER
DNA
NACH
DER
AUSSALZMETHODE
.
34
4.1.2.2
PLASMIDISOLIERUNG
.
34
4.1.2.2.1
SCHNELLE
PLASMIDISOLIERUNG
.
34
4.1.2.2.2
MODIFIZIERTE
ALKALISCHE
LYSE/PEG-PRAEZIPITATION
.
34
4.1.2.2.3
PLASMIDISOLIERUNG
MIT
DEM
NUCLEOSPIN
KIT
.
35
4.1.2.3
ISOLIERUNG
VON
RNA
.
35
4.1.3
ENZYMATISCHE
REAKTIONEN
MIT
NUKLEINSAEUREN
.
36
4.1.3.1
RESTRIKTIONSVERDAU
VON
DNA
.
36
4.1.3.2
POLYMERASE-KETTENREAKTION
(PCR)
.
36
4.1.3.3
REVERSE
TRANSKRIPTION
UND
PCR
(RT-PCR)
.
37
4.1.3.4
REINIGUNG
VON
PCR-PRODUKTEN
.
37
4.1.3.5
KLONIERUNG
VON
PCR-PRODUKTEN
.
37
4.1.3.6
NACHWEIS
EINER
INSERTION
IN
REKOMBINANTEN
BAKTERIEN
MITTELS
PCR
.
37
4.1.3.7
HERSTELLUNG
VON
DIGOXIGENIN-MARKIERTEN
SONDEN
MITTELS
PCR
.
38
4.1.4
SEQUENZIERUNG
.
38
4.1.5
GELELEKTROPHORETISCHE
AUFTRENNUNG
VON
NUKLEINSAEUREN
.
38
4.1.5.1
AUFTRENNUNG
VON
DNA
AUF
AGAROSEGELEN
.
38
4.1.5.2
SOUTHERNBLOT
.
39
4.1.5.3
AUFTRENNUNG
VON
PCR-PRODUKTEN
IN
EINEM
POLYACRYLAMIDGEL
.
39
I
NHALTSVERZEICHNIS
_
1U
4.1.5.4
SILBERFAERBUNG
VON
POLYACRYLAMIDGELEN
.
39
4.1.5.5
AGAROSEGELELEKTROPHORESE
VON
RNA
.
40
4.1.5.6
NORTHERNBLOT
.
40
4.1.6
HYBRIDISIERUNG
MIT
DIGOXIGENIN-MARKIERTEN
SONDEN
UND
DETEKTION
.
40
4.1.6.1
HYBRIDISIERUNG
MIT
DIGOXIGENIN-MARKIERTEN
DNA-SONDEN
UND
DETEKTION
.
40
4.1.6.2
HYBRIDISIERUNG
MIT
DIGOXIGENIN-MARKIERTEN
OLIGONUKLEOTIDEN
.
41
4.1.7
ISOLIERUNG
VON
DNA-FRAGMENTEN
AUS
AGAROSEGELEN
.
41
4.1.7.1
ZENTRIFUGATION
DURCH
GLASWOLLE
.
41
4.1.7.2
ISOLIERUNG
MITTELS
GLASMILCH
.
42
4.1.8
SUBKLONIERUNG
VON
DNA-FRAGMENTEN
.
42
4.2
ARBEITEN
MIT
BAKTERIEN
.
43
4.2.1
LAGERUNG
.
43
4.2.2
KOMPETENZINDUKTION
VON
BAKTERIEN
MIT
CACI
2
(TANG
ET
AL.
1994)
.
43
4.2.3
TRANSFORMATION
KOMPETENTER
BAKTERIEN
.
43
4.3
ARBEITEN
MIT
EUKARYONTISCHEN
ZELLEN
.
44
4.3.1
ALLGEMEINE
ZELLKULTUR
.
44
4.3.2
HERSTELLUNG
VON
HYBRIDOMEN
.
44
4.3.2.1
GEWINNUNG
VON
ZELLEN
FUER
DIE
KULTIVIERUNG
VON
FEEDERLAYER
FUER
HYBRIDOME
.
44
4.3.2.2
FUSION
VON
ZELLEN
ZUR
GENERIERUNG
VON
HYBRIDOMEN
.
45
4.3.3
TRANSFEKTION
VON
EUKARYONTISCHEN
ZELLEN
MITTELS
ELEKTROPORATION
.
45
4.3.4
STIMULATION
VON
ZELLEN
MIT
CYTOKINEN
.
46
4.3.5
INDUKTION
DER
OBERFLAECHENEXPRESSION
VON
HLA-E
DURCH
INKUBATION
BEI
26C
UND/ODER
MIT
PEPTID
UND
CYTOTOXIZITAETSVERSUCH
.
46
4.3.6
INDIREKTE
IMMUNFLUORESZENZ
.
47
4.3.7
SORTIEREN
VON
ZELLEN
.
47
4.3.8
ISOLIERUNG
VON
PERIPHEREN
BLUTLYMPHOZYTEN
(PBL)
.
47
4.4
PROTEINCHEMISCHE
METHODEN
.
48
4.4.1
AUFREINIGUNG
EINES
REKOMBINANTEN
PROTEINS
MITTELS
AFFINITAETSCHROMATOGRAPHIE
.
48
4.4.1.1
INDUKTION
UND
REINIGUNG
IM
KLEINEN
MASSSTAB
("BATCH-METHODE
"
)
.
48
4.4.1.2
BELADUNG
DER
SAEULE
MIT
NICKEL
UND
REGENERATION
DER
SAEULE
.
48
4.4.1.3
INDUKTION
UND
REINIGUNG
IM
GROSSEN
MASSSTAB
(10-ML-SAEULE)
.
49
4.4.2
HERSTELLUNG
VON
ZELL-LYSATEN
.
49
4.4.3
KONZENTRATIONSBESTIMMUNG
VON
PROTEINEN
.
50
4.4.4
IMMUNPRAEZIPITATION
.
50
4.4.4.1
VORBEREITUNG
DER
SEPHAROSE
.
50
4.4.4.2
PRAEZIPITATION
.
50
4.4.4.3
ABSPALTUNG
VON
OLIGOSACCHARIDEN
MIT
ENDOGLYCOSIDASE
F
.
51
4.4.4.4
ABSPALTUNG
VON
OLIGOSACCHARIDEN
MIT
ENDOGLYCOSIDASE
H
.
51
4.4.5
SDS-POLYACRYLAMID-GELELEKTROPHORESE
.
52
4.4.6
SILBERFAERBUNG
VON
PROTEINGELEN
.
52
4.4.7
UEBERTRAGUNG
VON
PROTEINEN
AUF
NITROCELLULOSE
(WESTERNBLOT)
.
53
4.4.8
IMMUNDETEKTION
DES
WESTEMBLOT
.
53
INHALTSVERZEICHNIS
_
IV
4.4.9
"ENZYME
LINKED
IMMUNOSORBENT
ASSAY"
(ELISA)
.
53
UEBERSICHT
UEBER
DIE
IM
ELISA
VERWENDETEN
KOMBINATIONEN
.
54
4.4.10
BESTIMMUNG
DES
ISOTYPS
VON
MONOKLONALEN
ANTIKOERPERN
.
54
4.4.11
IMMUNISIERUNG
MIT
DEM
REKOMBINANTEN
A1-POLYPEPTID
UND
HERSTELLUNG
VON
ANTISEREN
.
54
4.4.11.1
IMMUNISIERUNG
EINES
KANINCHENS
.
55
4.4.11.2
IMMUNISIERUNG
VON
MAEUSEN
.
55
4.4.11.3
GEWINNUNG
DER
ANTISEREN
.
55
5
ERGEBNISSE
.
56
5.1
UNTERSUCHUNGEN
ZUR
EXPRESSION
UND
STIMULIERBARKEIT
VON
HLA-G
IN
GEWEBEN
UND
ZELLINIEN
56
5.1.1
UNTERSUCHUNG
DES
HLA-G-EXPRESSIONSMUSTERS
IN
HAUTBIOPSIEN
.
56
5.1.2
UNTERSUCHUNG
DER
EXPRESSION
VON
HLA-G
IN
GEHIRNMATERIAL
UND
GLIOBLASTOMZELLINIEN
.
60
5.1.2.1
NACHWEIS
DER
EXPRESSION
VON
HLA-G
IN
GEHIRNMATERIAL
.
60
5.1.2.2
UEBERPRUEFUNG
EINER
HLA-G-SPEZIFISCHEN
SONDE
.
62
5.1.2.3
NACHWEIS
DER
HLA-G-EXPRESSION
IN
GLIOBLASTOMZELLINIEN
NACH
STIMULATION
MIT
IFNY
IM
NORTHERNBLOT
.
63
5.1.2.4
NACHWEIS
DER
ALTERNATIV
GESPLEISSTEN
HLA-G-MRNA
IN
GLIOBLASTOMZELLINIEN
NACH
STIMULATION
MIT
IFNY
MITTELS
RT-PCR
.
64
5.1.2.5
UNTERSUCHUNG
DER
HLA-G-EXPRESSION
IN
GLIOBLASTOMZELLINIEN
AUF
PROTEINEBENE
MITTELS
FACS-ANALYSE
UND
WESTERNBLOT
.
65
5.1.3
HLA-G-EXPRESSION
IN
MUSKELBIOPSIEN
UND
MYOBLASTEN
.
68
5.2
HERSTELLUNG
UND
CHARAKTERISIERUNG
EINES
KANINCHENSERUMS
UND
EINES
MONOKLONALEN
ANTIKOERPERS
GEGEN
DIE
A1-DOMAENE
VON
HLA-G
.
70
5.2.1
HERSTELLUNG
UND
CHARAKTERISIERUNG
EINES
KANINCHENSERUMS
GEGEN
DIE
A1-DOMAENE
VON
HLA-G
.
71
5.2.2
UNTERSUCHUNG
DER
HYBRIDOME
.
73
5.2.2.1
CHARAKTERISIERUNG
DES
ANTIKOERPERS
2G12
.
74
5.2.2.2
NACHWEIS
DER
HLA-G-PROTEINE
MIT
DEM
AK
2G12
UND
DEM
KANINCHENSERUM
.
79
5.3
CHARAKTERISIERUNG
DER
HLA-G-TRANSFEKTANTEN
.
80
5.4
EXPRESSION
DER
HLA-G-ISOFORMEN
.
86
5.4.1
NACHWEIS
DER
PROTEINEXPRESSION
IN
DEN
HLA-G-TRANSFEKTANTEN
.
86
5.4.2
ENDOH-SENSITIVITAET
DER
HLA-G-ISOFORMEN
.
90
5.4.3
CHARAKTERISIERUNG
VON
MAK
IN
BEZUG
AUF
IHRE
BINDUNG
AN
DIE
HLA-G-ISOFORMEN
.
91
5.5
STABILISIERUNG
VON
FUNKTIONELLEM
HLA-E
AUF
DER
ZELLOBERFLAECHE
DER
HLA-G-TRANSFEKTANTEN
.
94
5.5.1
STABILISIERUNG
VON
HLA-E
AUF
DEN
TRANSFEKTANTEN
DER
HLA-G-ISOFORMEN
.
94
5.5.2
FUNKTIONELLES
HLA-E
AUF
DEN
HLA-G-TRANSFEKTANTEN
INTERAGIERT
MIT
DEM
LOESLICHEN
CD94/NKG2A-REZEPTORTETRAMER
.
96
5.5.3
BEEINFLUSSUNG
DER
NK-AKTIVITAET
DURCH
DIE
FUNKTIONELLE
STABILISIERUNG
VON
HLA-E
IN
DEN
HLA-G-TRANSFEKTANTEN
.
101
5.6
INTERAKTIONEN
DER
HLA-G-ISOFORMEN
.
110
I
NHALTSVERZEICHNIS
6
DISKUSSION
.
113
6.1
UNTERSUCHUNGEN
ZUR
EXPRESSION
VON
HLA-G
.
113
6.2
IFNY
ERHOEHT
SELEKTIV
DIE
EXPRESSION
VON
G1M
IN
GLIOBLASTOMZELLEN
UND
MYOBLASTEN
.117
6.3
WO
WERDEN
DIE
HLA-G-ISOFORMEN
IN
DER
ZELLE
EXPRIMIERT?
.
120
ERKENNUNG
VON
HLA-G
UND
DEN
HLA-G-ISOFORMEN
DURCH
DEN
AK
W6/32
UND
MOEGLICHE
INTERAKTION
MIT
SS
2
M
.
121
6.4
HLA-G
UND
DIE
UEBER
HLA-E
VERMITTELTE
INDIREKTE
INTERAKTION
MIT
CD94/NKG2A
.
122
6.4.1
DAS
PEPTID
G
3
.I
T
AUS
DER
SIGNALSEQUENZ
VON
HLA-G
IST
EIN
LIGAND
FUER
HLA-E
UND
KANN
DESSEN
OBERFLAECHENEXPRESSION
STABILISIEREN
.
123
6.4.2
DAS
PEPTID
B7J.N
STABILISIERT
NACH
EXOGENER
ZUGABE
ZU
.221-ZELLEN
BESSER
IM
VERGLEICH
MIT
DEM
PEPTID
GIR
.
125
6.4.3
CD94/NKG2A
ERKENNT
HLA-E
KOMPLEXIERT
MIT
EINEM
GEEIGNETEN
LIGANDEN
AUF
X63
TRANSFEKTANTEN,
INTERAGIERT
ABER
NICHT
DIREKT
MIT
HLA-G
ODER
HLA-B27
.
126
6.4.4
.221-G1M
UND
K-562-G1M-TRANSFEKTANTEN
UNTERSCHEIDEN
SICH
IN
BEZUG
AUF
DIE
STAERKE
DER
HLA-E-STABILISIERUNG
.
128
6.4.5
DIE
TRANSFEKTANTEN
DER
HLA-G-ISOFORMEN
UNTERSCHEIDEN
SICH
IN
BEZUG
AUF
IHRE
FAEHIGKEIT,
HLA-E
AUF
DER
ZELLOBERFLAECHE
ZU
STABILISIEREN
UND
DIE
LYSE
UEBER
CD94/NKG2A
ZU
INHIBIEREN
.129
7
ZUSAMMENFASSUNG
.
133
8
LITERATUR
.
135 |
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