Komponenten der Kohlenstoffkatabolitrepression in B. megaterium:
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2002
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1
ZUSAMMENFASSUNG
1
2
EINLEITUNG
2
2.1.
AUFNAHME
VON
KOHLENSTOFFQUELLEN
IN
BAKTERIEN
2
2.1.1.
ABC-TRANSPORTER
2
2
1.2.
MFS-TRANSPORTER
3
2.1.3.
DAS
PHOSPHOENOLPYRUVAT-PHOSPHOTRANSFERASESYSTEM
(PEP:PTS)
3
2.2.
REGULATIONSVORGAENGE
IN
BAKTERIEN
ALS
ADAPTATION
AN
VERAENDERTE
UMWEITBEDINGUNGEN
10
2.3.
KOHLENSTOFF-KATABOLLTREPRESSION
(KKR)
11
2.3
1.
KOHLENSTOFFKATABOLITREPRESSION
IN
ESCHERICHIA
COLI
11
2.3.2.
KOHLENSTOFFKATABOLITREPRESSION
IN
BACILLUS
SPEZIES
UND
ANDEREN
GRAM-POSITIVEN
BAKTERIEN
13
2.3.3.
CCPA-VERMITTELTE
KKR
IN
BACILLUS
16
2.3.4.
KOMPONENTEN
DER
KKR
DES
XYAOPERONS
VON
B.
MEGATERIUM
20
2.4.
FRAGESTELLUNGEN
IN
DIESER ARBEIT
21
3
ERGEBNISSE
22
3.1.
SEQUENZIERUNG
DES
PUTATIVEN
PTSGHAOPERONS
VON
B.
MEGATERIUM
22
3.1.1.
VERVOLLSTAENDIGUNG
DER
SEQUENZ
DES
PUTATIVEN
PTSGHAOPERONS
AUS
B.
MEGATERIUM
22
3.1.2.
RECHNERGESTUETZTE
SEQUENZANALYSE
DES
PUTATIVEN
PTSGHAOPERONS
VON
B.
MEGATERIUM
22
3.2.
AUFREINIGUNG
VON
HPR
UND
HPR(SER-P)
30
UEBERPRODUKTION
VON
HPR
IN
B.
MEGATERIUM
30
3.2.2
SAEULENCHROMATOGRAPHISCHE
REINIGUNG
VON
WILDTYP
HPR
31
3.2.3.
VERSUCH
DER
ETABLIERUNG
EINES
AUFREINIGUNGSPROTOKOLLES
AN
EINER
BIOCAD
VISION
WORKSTATION
33
3.2.4.
REINIGUNG
VON
HPR(SER-P)
34
3.2.5
UEBEREXPRESSION
UND
AUFREINIGUNG
VON
HPR(S46D)
AUS
B.
MEGATERIUM
35
3.2.6.
AUFREINIGUNG
VON
[HIS]
6
HPR
37
3.3.
KONSTRUKTION
VON
STAEMMEN
MIT
DELETIONEN
IN
VERSCHIEDENEN
KOMPONENTEN
DER
KOHLENSTOFF-KATABOLLTREPRESSLON
38
3.3.1.
INAKTIVIERUNG
DES
PTSH-GENS
39
3.3.2.
INAKTIVIERUNG
DES
GENS
FUER
DIE
GLUKOSEKINASE
40
3.3.3.
INAKTIVIERUNG
DES
GENS
FUER
DEN
XYL
REPRESSOR
41
3.4.
ZUCKERAUFNAHME
IN
B.
MEGATERIUM
WH348
UND
WH418
(PTSHZ)
44
3.4.1.
GLUKOSEAUFNAHME
IN
B.
MEGATERIUM
WH348
UND
WH418
(PTSHI)
44
3 4
2.
FRUKTOSEAUFNAHME
IN
B
MEGATERIUM
WH348
UND
WH418
(PTSHI)
47
3.4.3.
MANNITOLAUFNAHME
IN
B.
MEGATERIUM
WH348
UND
WH418
(PTSHI)
49
3.4.4.
BESTIMMUNG
VON
K
M
UND
VM.
X
DES
ZWEITEN
GLUKOSETRANSPORTERS
50
3.5.
SUCHE
NACH
WEITEREN
KOMPONENTEN
DER
KOHLENSTOFFKATABOLLTREPRESSION
IN
B.
MEGATERIUM
50
3.5.1.
SUCHE
NACH
CRH
50
3.5
2.
SUCHE
NACH
DER
HPR-KINASE
54
3.6.
SUCHE
NACH
HPR-SUPPRESSIONSMUTANTEN
56
3.6.1.
KONSTRUKTION
VON
PLASMIDEN
MIT
UNGERICHTET
MUTIERTEM
HPR
56
3.6
2.
DIE
TESTSTAEMME
B
MEGATERIUM
WH429,
WH430,
WH431
WH465
UND WH466
60
3.6
3
ETABLIERUNG
EINES
ELEKTROPORATIONSPROTOKOLLES
FUER
B.
MEGATERIUM
64
3.6.4.
ELEKTROPORATION
VON
B
MEGATERIUM
WH429,
WH430
UND
WH431
68
3.6.5.
DIE
TESTSTAEMME
B.
SUBTILIS
WH468,
WH469
UND
WH470
69
3.6
6.
INTERAKTION
VON
HPR(SER-P)
S
MIT
[HIS]
6
CCPA
8
,/CCPA
296YR/300AE/304RD
74
4
DISKUSSION
78
4.1.
ANALYSE
DER
PFSGHAREGION
VON
B.
MEGATERIUM
4.1
1.
SEQUENZANALYSE
4.1.2
ELI'
-
DIE
PUTATIVE
GLUKOSE-PERMEASE
78
78
81
4.1.3.
EL
-
EIN
VERGLEICH
MIT
ANDEREN
PEP
BINDENDEN
ENZYMEN
83
4.2.
REINIGUNG
VON
HPR
FUER
IN
VITRO
VERSUCHE
87
4
2
1.
REINIGUNG
UND
VERWENDUNG
VON
[HISFEHPR
87
4.2
2.
REINIGUNG
UND
VERWENDUNG
VON
WILDTYP
HPR
UND
HPR(S46D)
87
4.3.
GLUKOSE-TRANSPORT
UEBER
EINE
ALTERNATIVES
AUFNAHMESYSTEM
88
4.4.
DER
WUCHSDEFEKT
EINER
PFSH-MUTANTE
89
4
4.1
VERLUST
VON
HPR(SER-P)
ALS
KOAKTIVATOR
VON
CCPA
ALS
MOEGLICHE
URSACHE
FUER
DEN
WUCHSDEFEKT
VON
WH418
-
KORRELATION
ZU
DEM
WUCHSDEFEKT
EINER
CCPA-MUTANTE?
90
4.5.
STAEMME
MIT
REDUZIERTER
KOHLENSTOFFKATABOLITREPRESSION
92
4.5.1
DIE
ROLLE
VON
CCPA
92
4.5.2.
DIE
ROLLE
VON
HPR
93
4.5.3.
DIE
ROLLE
VON
XYLR
94
4.5.4.
DIE
ROLLE
DER
GLUKOSEKINASE
94
4.6.
STAEMME
MIT
CCPA-PUNKTMUTATIONEN
95
4.6.1.
8.
MEGATENUM
STAMME
MIT
AMINOSAEUREAUSTAUSCHEN
IN
DER
POSTULIERTEN
HPR
BINDEFLAECHE
97
4.6
2.8
SUBTILIS
STAEMME
MIT
AMINOSAEUREAUSTAUSCHEN
IN
DER
POSTULIERTEN
HPR-BINDEFLAECHE
97
4.7.
SUCHE
NACH
DER
HPRK/P
VON
B.
MEGATERIUM
99
4.8.
GIBT
ES
CRH
IN
B.
MEGATERIUM?
100
4.9.
UNGERICHTETE
MUTAGENESE
VON
PTSH
103
4.10.
ELEKTROPORATION
VON
B.
MEGATERIUM
104
5
MATERIAL
UND
METHODEN
106
5.1.
MATERIAL
106
5.2.
VERWENDETE
OLIGONUKLEOTIDE
109
5.3.
VERWENDETE
BAKTERIENSTAEMME
UND
PLASMIDE
113
5.4.
PUFFER,
MEDIEN
UND
LOESUNGEN
114
ALLGEMEINE
PUFFER
UND
LOESUNGEN
115
5.4.1.
PUFFER
UND
LOESUNGEN
FUER
DIE
DNA-GELELEKTROPHORESE
115
5.4.2.
PUFFER
UND
LOESUNGEN
FUER
DIE
DENATURIERENDE
PROTEIN-GELELEKTROPHORESE
(SDS-PAGE)
115
5.4.3.
PUFFER
UND
LOESUNGEN
FUER
DIE
NICHT-DENATURIERENDE
PROTEIN-GELELEKTROPHORESE
115
5.4.4.
PUFFER
ZUR
PROTEINAUFREINIGUNG
115
5.4.5.
GROESSENSTANDARDS
FUER
DIE
GELELEKTROPHORESE
116
5.4.6.
BAKTENENNAEHRMEDIEN
116
5.5.
METHODEN
117
5.5
1.
ALLGEMEINE
METHODEN
117
5.5.2.
ANZUCHT
VON
BAKTERIEN
118
5.5
3.
TRANSFORMATION
VON
BAKTERIEN
118
5.5.4.
INTEGRATION
INS
CHROMOSOM
VON
8
MEGATENUM
120
5.5.5.
METHODEN
ZUR
PROTEINREINIGUNG
UND
-CHARAKTERISIERUNG
121
5.5.6.
IMMUNOLOGISCHE
METHODEN
123
5
5.7.
ENZYMAKTIVITAETSMESSUNGEN
124
5
5.8
METHODEN
MIT
DESOXYRIBONUKLEINSAEUREN
125
6
LITERATURVERZEICHNIS
129
7
ANHANG
149
7.1.
KONIERUNG
VON
PLASMIDEN
MIT
MUTIERTEM
PTSH
ZUR
INTEGRATION
IN
DAS
CHROMOSOM
VON
B.
MEGATERIUM
149
7.2.
VERLAUF
DES
PH-WERTES
IN
B.
SUBTILIS
UND
B.
MEGATERIUM
KULTUREN
IN
LB
+
0,5%
GLUKOSE
158
7.3.
DIE
INTERAKTIONSFLAECHEN
VON
HPR
MIT
VERSCHIEDENEN
PARTNERPROTEINEN
159 |
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