Funktionsuntersuchung zur Katabolitenrepression in Gram-positiven Bakterien:
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| Sprache: | German |
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2002
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INHALT
1
INHALT
INHALTSVERZEICHNIS
.
1
ABKUERZUNGSVERZEICHNIS
.
4
1
ZUSAMMENFASSUNG
7
2
EINLEITUNG
8
2.1
TRANSKRIPTIONSREGULATION
ALS
ANPASSUNGSMECHANISMUS
_
8
2.1.1
REGULATION
DURCH
REGULATORPROTEINE
_
8
22
KOHLENSTOFF-KATABOLITENREPRESSION
(KKR)
9
23
KOMPONENTEN
DER
CCPA-VERMITTELTEN
KATABOLITENREPRESSION
IN
BACILLUS
_
14
2.3.1
CCPA
UND
KOFAKTOREN
14
2.3.1.1
HPR
15
2.3.2
CIS-AKTIVE
SEQUENZEN
_
17
2A
WECHSELWIRKUNG
VON
PROTEINEN
MIT
NUKLEINSAEUREN
18
23
REGULATION
DER
XYN/
XYL-OPERONS
IN
B.
SUBTILIS
_
19
3
MATERIALIEN
UND
METHODEN
21
3.1
MATERIALIEN
21
3.1.1
CHEMIKALIEN
_
21
3.1.2
HILFSMITTEL
_
22
3.1.3
GERAETE
UND
APPARATUREN
.
23
3.1.4
KOMMERZIELL
ERHAELTLICHE
SYSTEME
_
24
3.15
PROTEINE
UND
ENZYME
_
24
3.1.6
BAKTERIENSTAEMME
25
3.1.7
PLASMIDE
25
3.1.8
OLIGONUKLEOTIDE
25
32
PUFFER,
LOESUNGEN
UND
MEDIEN
28
3.2.1
ALLGEMEINE
PUFFER
UND
LOESUNGEN
_
28
3.2.2
PUFFER
UND
LOESUNGEN
FUER
DIE
DNA-GELELEKTROPHORESE
_
28
3.2.3
PUFFER
UND
LOESUNGEN
FUER
DIE
DENATURIERENDE
PROTEIN-GELELEKTROPHORESE
_
29
3.2.4
PUFFER
UND
LOESUNGEN
FUER
DIE
NICHT-DENATURIERENDE
PROTEIN-GELELEKTROPHORESE
29
3.2.5
GROESSENSTANDARDS
FUER
DIE
GELELEKTROPHORESE
_
30
2
3.2.6
PUFFER
ZUR
PROTEINAUFREINIGUNG
_
30
3.2.7
BAKTERIENNAEHRMEDIEN
31
3.2.8
ENZYMSTAMMLOESUNGEN
32
33
METHODEN
32
3.3.1
ALLGEMEINE
METHODEN
32
3.3.2
HERSTELLUNG
VON
ELEKTROKOMPETENTEN
ZELLEN
UND
ELEKTROPORATION
VON
B.
SUBTILIS
33
3.3.2.1
ELEKTROKOMPETENTE
ZELLEN
VON
B.
SUBTILIS
_
33
3.3.2.2
ELEKTROPORATION
VON
B.
SUBTILIS
33
3.3.3
METHODE
MIT
DESOXYRIBONUKLEINSAEURE
34
3.3.3.1
DNA
MODIFIZIERENDE
ENZYME
_
34
3.3.3.2
ELUTION
VON
DNA
AUS
PAA-GELEN
_
34
3.3.3.3
PRAEPARATION
VON
5'
RADIOAKTIV
ENDMARKIERTEN
DNA
FRAGMANTEN
_
34
33.3.4
POLYMERASE
KETTENREAKTION
(PCR)
34
3.3.3.5
PCR
MIT
HILFE
VON
.READY
TO
GO
PCR-BEADS
'
(PHARMACIA
BIOTECH,
FREIBURG)
35
33.3.6
KOLONIE-PCR
(YYPCR-SCREENING
"
)
35
333.7
ORTSGERICHTETE
MUTAGENESE
DURCH
ZWEISTUFIGE
PCR
36
3.3.4
METHODEN
ZUR
PROTEINAUFREINIGUNG
_
36
33.4.1
ANIONENAUSTAUSCHCHROMATOGRAPHIE
ZUR
AUFREINIGUNG
VON
HPR
BZW.
HPRSER46P
36
33.4.2
ANIONENAUSTAUSCHCHROMATOGRAHIE
AN
DER
BIOCAD
VISION
WORKSTATION
37
33.4.3
AUFKONZENTRIERUNG
VON
PROTEINLOESUNGEN
MITTELS
DRUCKDIALYSE
37
33.4.4
PRAEPARATIVE
GELFILTRATION
37
3.3.4.5
IN
VITRO
PHOSPHORYLIERUNG
VON
HPR
AN
SERIN46
37
33.4.6
PROTEINKONZENTRATIONSBESTIMMUNG
_
38
3.3.5
BESTIMMUNG
DER
SS-XYLOSIDASEAKTIVITAET
_
38
3.3.6
ZUCKERAUFTIAHMEMESSUNGEN
BEI
B.
SUBTILIS
39
3.3.7
WESTERN
BLOT
40
3.3.8
BERECHNUNG
DER
GLEICHGEWICHTSKONSTANTEN
40
3.3.9
METHODEN
ZUR
ANALYSE
VON
PROTEIN-DNA-WECHSELWIRKUNGEN
42
33.9.1
GELMOBILITAETSANALYSE
42
33.9.2
DNASEL-SCHUTZEXPERIMENTE
_
42
3.3.93
1,10-PHENANTHROLIN
KUPFER
SCHUTZEXPERIMENTE
_
44
3.3.10
SELEKTION
SPEZIFISCHER
DNA-BINDESTELLEN
(SELEX)
44
4
ERGEBNISSE
46
4.1
IN
VITRO
UNTERSUCHUNGEN
ZUR
ROLLE
VON
KOFAKTOREN
DER
CCPA-CRE
INTERAKTION
46
4.1.1
DER
SPEZIFISCHE
EINFLUSS
VON
HPRSER46P
AUF
DIE
CCPA-CRE
INTERAKTION
_
46
4.1.2
UNTERSUCHUNG
DER
STABILITAET
DES
PROTEIN-CRE
KOMPLEX
48
4.13
IDENTIFIZIERUNG
VON
HPRSER46P
IM
KOMPLEX
51
4.1.4
EINFLUSS
ANDERER
POTENTIELLEN
KOFAKTOREN
AUF
DIE
CCPA-CRE
INTERAKTION
_
53
4.1.4.1
UNTERSUCHUNGEN
DURCH
GELMOBILITAETSEXPERIMENTE
53
INHALT
3
4.1.4.2
UNTERSUCHUNGEN
DURCH
GLEICHGEWICHTSDIALYSE
55
4.1.5
QUANTITATIVE
ANALYSE
DER
CCPA-CRE
INTERAKTION
DURCH
GELMOBILITAETSEXPERIMENTE
_
58
ABB.
4.6
AUTORADIOGRAMM
DES
GELMOBILITAETSEXPERIMENTS
ZUR
BESTIMMUNG
DER
BINDEKONSTANTE
DES
CCPA-CRE
MIT
HPRSER46P
59
42
GERICHTETE
MUTATIONEN
IN
HPR
60
4.2.1
VORBEREITENDE
ARBEITEN
_
61
4.2.1.1
KLONIERUNG
EINES
EXPRESSIONSVEKTORS
UND
AUFREINIGUNG
VON
WILDTYP
HPR
61
4.2.2
HERSTELLUNG
DER
PTSH
MUTANTEN_
64
4.2.3
IN
VITRO
STUDIEN
MIT
HPR-VARIANTEN
_
66
4.2.3.1
ATP
BZW.
PEP-ABHAENGIGE
PHOSPHORYLIERUNGEN
VON
HPR-MUTANTEN
66
4.23.2
AUSWIRKUNGEN
VON
HPR-MUTANTEN
AUF
DIE
CCPA-CRE
INTERAKTION
67
4.2.4
IN
VIVO
STUDIEN
MIT
HPR-VARIANTEN
_
68
4.2.4.1
EINFUEGEN
DES
PROMOTOR-BEREICHS
_
68
4.2.4.2
KONSTRUKTION
DER
VEKTOREN
FUER
DIE
IN
VIVO
UNTERSUCHUNGEN
DER
REGULATORISCHEN
FUNKTION
DER
HPR-V
ARIANTEN
_
7
0
4.2.43
KONSTRUKTION
EINES
B.
SUBTILIS
TESTSTAMMS
MIT
DELETIONEN
IM
PTSH-UNAE
CRH-GEN
71
4.2.4.4
IDENTIFIZIERUNG
VON
PTEH-MUTANTEN
73
4.2.4.4.1
VERGLEICH
DER
EXPRESSIONSNIVEAUS
DURCH
WESTEMBLOT
ANALYSE
73
4.2.4.5
AUSWIRKUNGEN
DER
MUTATIONEN
IN
PTSH
AUF
DEN
GLUKOSETRANSPORT
74
4.2.4.OE
AUSWIRKUNGEN
DER
MUTATIONEN
IN
PTSH
AUF
DIE
KATABOLITREPRESSION
_
75
43
ETABLIERUNG
EINES
IN
VITRO
SYSTEMS
ZUR
SELEKTION
SPEZIFISCH
GEBUNDENER
DNA-SEQUENZEN
_
76
4.3.1
VORBEREITUNG
DES
OLIGONUKLEOTIDGEMISCHES
_
TI
4.3.2
SELEKTION
VON
EFFEKTORENABHAENGIG
CCPA-SPEZIFISCH
GEBUNDENEN
DNA-SEQUENZEN
_
77
4.3.3
ANALYSE
DER
SELEKTIONIERTEN
DNA
79
4.3.4
GELMOBILITAETSANALYSEN
MIT
IDENTIFIZIERTEN
DNA-SEQUENZEN
_
80
4.3.5
SCHUTZEXPERIMENTE
ZUR
IN
VITRO
CHARAKTERISIERUNG
DER
WECHSELWIRKUNGEN
ZWISCHEN
CCPA
UND
DNA-SEQUENZEN
DER
SELEKTIONSEXPERIMENTE
_
83
43.5.1
VORBEREITENDE ARBEITEN
FUER
SCHUTZEXPERIMENTE
_
83
43.5.2
DNASEL-SCHUTZEXPERIMENTE
ZUR
BESTIMMUNG
DER
SPEZIFITAET
DER
KOMPLEXE
84
43.5.3
1,10-PHENANTHROLIN-KUPFER-SCHUTZEXPERIMENTE
ZUR
BESTIMMUNG
DER
SPEZIFITAET
DER
KOMPLEXE
85
5
DISKUSSION
88
5.1
DIE
INTERAKTION
DES
KOMPRESSORS
HPRSER46P
MIT
CCPA
UND
CRE
88
52
DIE
WECHSELWIRKUNG
ZWISCHEN
HPRSER46P
UND
CCPA
89
53
SEMIQUANTITATIVE
BINDEKONSTANTE
VON
CCPA
UND
CRE
91
4
SA
DIE
ROLLE
POTENTIELLER
NIEDERMOLEKULARER
EFFEKTOREN
BEI
DER
CCPA-CRE
INTERAKTION
_
93
55
INTERPRETATION
DER
HPR-MUTANTEN
95
55.1
AUFREINIGUNG
DER
HPR-VARIANTEN
_
55.2
SERIN-46
_
5.5.3
HISTIDIN-15
100
5.5.4
ARGININ-17
101
5.6
SELEKTION
CCPA-SPEZIFISCH
GEBUNDENER
DNA-SEQUENZEN
_
102
6
LITERATURVERZEICHNIS
107
7
ANHANG
119 |
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