Klonierung von BMPRIA-Lambda-c- und BMPRII-Il4-Alpha-Hybridrezeptoren und Expression in Ba-F3-Zellen:
Gespeichert in:
| 1. Verfasser: | |
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| Format: | Buch |
| Sprache: | German |
| Veröffentlicht: |
2001
|
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| Beschreibung: | Würzburg, Univ., Diss., 2002 |
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1
1
EINLEITUNG
1.1
DIE
TGFSS-SUPERFAMLLLE
1
1.1.1
MITGLIEDER
UND
VORKOMMEN
1
1.1.2
SIGNALUEBERTRAGUNG
DURCH
TGFSS-REZEPTOREN
UND
DEREN
LIGANDEN
7
1.1.3
SIGNALUEBERTRAGUNG
DURCH
BMP-REZEPTOREN
UND
DEREN
LIGANDEN
12
1.2
BEDEUTUNG
VON
BMPS,
BMP-REZEPTOREN
UND
DEREN
SIGNALWEGE
16
1.2.1
EMBRYONALENTWICKLUNG
16
1.2.1.1
ALLGEMEIN
16
1.2.1.2
KNOCHEN-UND
KNORPELENTWICKLUNG
22
1.2.1.3
EXTREMITAETEN
27
1.2.1.4
MUSKELGEWEBE
33
1.2.15
LUNGE
35
1.2.1.6
NIERE
36
1.11.7
AUGE
37
1.11.8
NERVENGEWEBE
38
1.11.9
APOPTOSE
41
1.2.2
DAS
BMP-SYSTEM
UND
ERKRANKUNGEN
BEIM
MENSCHEN
41
1.12.1
PRIMAER
PULMONALE
HYPERTONIE
41
1.12.2
FRAKTURHEILUNG
43
1.12.3
EKTOPE
KNOCHENBILDUNG
43
1.12.4
CHONDRODYSPLASIEN
43
1.125
GELENKMALFORMATIONEN
44
1.116
BRACHYDAKTYLIE-SYNDROME
45
1.2.2.7
PSORIASIS
45
1.12.8
GLIOME
47
1.12.9
OSTEOSARKOM
47
1.2.2.10
LANGER-GIEDION-SYNDROM
48
1.2.3
BMPS
IM
KLINISCHEN
EINSATZ
48
1.3
ZIEL
DER
ARBEIT
49
2
MATERIAL
UND
METHODEN
50
2.1
ABKUERZUNGEN
(AUSSER
SL-ELNHELTEN)
50
2.2
CHEMIKALIEN
UND
ENZYME
53
2.3
BAKTERIENSTAEMME
53
2.4
VEKTOREN
UND
OLIGONUKLEOTLDE
53
2.4.1
EXPRESSIONSVEKTOREN
FUERE.
COLI
53
2.4.2
OLIGONUKLEOTIDE
54
2.5
ZELLINLEN
55
2.6
BEFRUCHTETE
HUEHNEREIER
55
2.7
MIKROBIOLOGISCHE
METHODEN
BEI
PROKARYONTISCHEN
ZELLEN
55
2.7.1
STERILISIEREN
55
2.7.2
KULTURMEDIEN
56
2.7.3
KULTURBEDINGUNGEN
57
2.7.4
KONSERVIEREN
VON
BAKTERIENKULTUREN
57
2.7.4.1
KURZZEITIGE
KONSERVIERUNG
57
2.7.4.2
LANGFRISTIGE
KONSERVIERUNG
57
2.7.5
TRANSFORMATION
VON.
COLI
MITTELS
ELEKTROPORATION
58
2.7.5.1
HERSTELLUNG
ELEKTROKOMPETENTER
ZELLEN
58
2.75.2
TRANSFORMATION
VON
E.
COLI
MITTELS
ELEKTROPORATION
58
2.75.3
TRANSFORMATIONSKONTROLLEN
59
2.75.4
TRANSFORMATIONSEFFIZIENZ
59
2.8
MOLEKULARBLOJOGJSCHE
METHODEN
59
2.8.1
KONZENTRATIONSBESTIMMUNG
VON
NUKLEINSAEUREN
59
2.8.2
SPALTUNG
VON
DNA
MIT
RESTRIKTIONSENDONUKLEASEN
60
2.8.3
DNA-AGAROSE-GELELEKTROPHORESE
60
2.8.4
DNA-GROESSENSTANDARDS
61
2.8.5
PHENOLISIEREN
VON
NUKLEINSAEUREN
61
2.8.6
AUSFAELLEN
VON
NUKLEINSAEUREN
61
2.8.7
POLYMERASE-KETTEN-REAKTION
(PCR)
62
II
2.8.8
ELUTION
VON
DNA-FRAGMENTEN
AUS
AGAROSE-GELEN
MITTELS
NUCLEOTRAP*
-KIT
63
2.8.9
LIGATION
VON
DNA-FRAGMENTEN
63
2.8.10
ANALYTISCHE
PLASMIDPRAEPARATION
(MINIPRAEP)
64
2.8.11
PRAEPARATIVE
PLASMIDPRAEPARATION
(CSCL-PRAEPARATION)
65
2.8.12
SEQUENZIERUNG
VON
DANN
67
2.9
PROTEINCHEMISCHE
METHODEN
68
2.9.1
SDS-POLYACRYLAMIDGELELEKTROPHORESE
68
2.9.2
PROTEINGROESSENSTANDARD
69
2.9.3
AUFARBEITUNG
VON
BA/F3-ZELLEN
FUER
PROTEINGELE
69
2.10
WESTERN-BLOT
70
2.11
ANTIGENDETEKTION
DURCH
PEROXIDASE
GEKOPPELTE
ANTIKOERPER
70
2.12
LUMINOLDETEKTLON
VON
OBERFLAECHENPROTEINEN
AUF
GANZEN
ZELLEN
71
2.13 KULTIVIERUNG
VON
EUKARYONTISCHEN
ZELLEN
73
2.13.1
STERILISIEREN
73
2.13.2
KULTIVIEREN
VON
IN
SUSPENSION
WACHSENDEN
BA/F3-ZELLEN
73
2.13.3
TRANSFEKTION
VON
BA/F3-ZELLEN
UND
SELEKTION
IN
ANTIBIOTIKUMHALTIGEN
MEDIUM
74
2.13.4
SELEKTION
TRANSFIZIERTER
BA/F3-ZELLEN
75
2.13.5
SUBKLONIERUNG
TRANSFIZIERTER
BA/F3-ZELLEN
76
2.13.6
EINFRIEREN
VON
BA/F3-ZELLEN
76
2.13.7
AUFTAUEN
VON
BA/F3-ZELLEN
76
2.13.8
PRODUKTION
VON
MIL3
76
2.13.9
PRAEPARATION
EMBRYONALER
ZELLEN
DER
HUEHNERGLIEDMASSENKNOSPE
[MODIFIZERT
NACH
RUPPERT]
77
2.14
AUFREINIGUNG
VON
MONOKLONALEN
ANTIKOERPERN
GEGEN
DAS
P5D4
EPITOP
(ANTI-P5D4-LGG-ANTIKOERPER)
AUS
HYBRIDOMA-ZELLMEDLUM
DER
HYBRIDOMA-ZELLINIE
P5D4
78
2.15
IN
VIVO
TESTSYSTEME
ZUR
BESTIMMUNG
DER
BIOLOGISCHEN
AKTIVITAET
79
2.15.1
MESSUNG
DER
PROTEOGLYKANSYNTHESE
VON
EMBRYONALEN
ZELLEN
DER
HUEHNCHENGLIEDMASSENKNOSPE
79
2.15.1.1
INKUBATION
MIT
RHBMP2
UND
35
SO
42
'
-MARKIERUNG
[MODIFIZIERT
NACH
RUPPERT]
79
2.15.1.2
ISOLIERUNG
DER
35
SO
42
-
MARKIERTEN
PROTEOGLYKANE
DURCH
AUSFAELLUNG
MIT
ALCIAN
BLAU
80
2.152
MESSUNG
DES
3
H-THYMIDIN-EMBAUS
IN
TRANSFIZIERTE
UND
NICHTTRANSFIZIERTE
BA/F3-ZELLEA
80
III
82
3
ERGEBNISSE
3.1
KLONIERUNG
VON
HYBRIDREZEPTOREN
RLY
UND
RLLA
UND
EXPRESSION
IN
COLI
82
3.1.1
PRAEPARATIVE
SPALTUNG
DER
PLASMIDE
PKCRCC
UND
PKCRP544
82
3.1.2
AUFREINIGUNG
DER
A7JO/-GESCHNITTENEN
VEKTOREN
PKCRCC
UND
PKCRP544
AUS
EINEM
PRAEPARATIVEN
GEL
83
3.1.3
AMPLIFIZIERUNG
DER
DNA-FRAGMENTE,
DIE
FUER
DIE
EXTRAZELLULAERDOMAENE
DES
HBMPR
TYP
1
A
(ALK
3)
UND
H
BMPR
TYP
2
KODIEREN
MITTELS
PCR
83
3.1.4
AEW-VERDAU
DER
PCR-AMPLIFIZIERTEN
DNA-FRAGMENTE,
DIE
FUER
DIE
EXTRAZELLULARDOMAENEN
DES
HBMPR
IA
(ALK-3)
UND
HBMPRII
KODIEREN
86
3.1.5
LIGATION
DES
VEKTORS
PKCRCC
(XHOL)
MIT
PCR
(A7IO/)RI
SOWIE
LIGATION
DES
VEKTORS
PKCRP544
(XHOL)
MIT
PCR
(XW)RII
87
3.1.6
TRANSFORMATION
DER
HYBRIDPLASMIDE
PKCRRIC
UND
PKCRP54RII4
IN
E.
COLI
JM
103
REC
A'
T
INKUBATION,
SELEKTION
UND
SUBKLONIERUNG
POSITIV
TRANSFORMIERTER
STAEMME
88
3.1.7
MINIPLASMIDPRAEPARATION
ERFOLGREICH
TRANSFORMIERTER
STAEMME
E.COLI
JM
103
REC
A'
MIT
DEN
HYBRIDPLASMIDEN
PKCRRIC
UND
PKCRP54RII4
89
3.1.8
AMPLIFIZIERUNG
DER
CDNA,
DIE
FUER
DIE
EXTRAZELLULARDOMAENE
DES
HBMPR
TYP
2
KODIERT
MITTELS
PCR
91
3.1.9
SPALTUNG
DES
PCR-PRODUKTES
DER
EXTRAZELLULARDOMAENE
DES
HBMPR
TYP
2
MITTELS
XAOZ-VERDAU
UND
AUFREINIGUNG
MITTELS
PRAEPARATIVEM
GEL
91
3.1.10
LIGATION
DES
VEKTORS
PKCRP544(LW)
MIT
PCR(AEAEO7)RII
92
3.1.11
TRANSFORMATION
DES
HYBRIDPLASMIDS
PKCRP54RII4
IN
BAKTERIENSTAMM
E.
COLI
JM
109
MITTELS
ELEKTROPORATION,
INKUBATION
UND
SELEKTION
MITTELS
AGARPLATTE
UNPD
SUBKLONIERUNG
POSITIV
TRANSFORMIERTER
STAEMME
93
3.1.12
MINIPLASMIDPRAEPARATION
ERFOLGREICH
TRANSFORMIERTER
STAEMME
E.
COLI
JM
109
MIT
DEM
HYBRIDPLASMID
PKCRP54RII4
94
3.1.13
IDENTIFIZIERUNG
DER
ORIENTIERUNG
DES
INSERTS
BMPRIA
(EXTRAZELLULAERE
DOMAENE)
IN
PKCRRIC
MITTELS
RESTRIKTIONSENDONUKLEASEVERDAU
BSML
95
3.1.14
IDENTIFIZIERUNG
DER
ORIENTIERUNG
DES
INSERTS
BMPRII
(EXTRAZELLULAERE
DOMAENE)
IN
PKCRP54RII4
MITTELS
RESTRIKTIONSENDONUKLEASEVERDAU
SSPL
96
3.1.15
SEQUENZIERUNG
DER
HYBRIDPLASMIDE
PKCRRIC
97
3.1.16
SEQUENZIERUNG
DER
HYBRIDPLASMIDE
PKCRP54RII4
97
3.1.17
GROSSPLASMIDPRAEPARATION
DER
HYBRIDPLASMIDE
PKCRRIC
97
3.1.18
SEQUENZIERUNG
DER
HYBRIDPLASMIDE
PKCRRIC
NACH
GROSSPLASMIDPRAEPARATION
98
3.1.19
GROSSPLASMIDPRAEPARATION
DER
HYBRIDPLASMIDE
PKCRF54RII4
98
3.1.20
SEQUENZIERUNG
DER
HYBRIDPLASMIDE
PKCRP54RII4
NACH
GROSSPLASMIDPRAEPARATION
99
IV
3.2
TRANSFEKTLON
DER
HYBRIDREZEPTOREN
RLY
UND
RLLA
IN
BA/F3-ZELLEN,
PROLLFERATIONSTESTS
MIT
BMP2
UND
P5D4-ANTLKOERPER
100
3.2.1
TRANSFEKTION
DER
HYBRIDPLASMIDE
PKCRRIC
UND
PKCRP54RII4
IN
BA/F3-ZELLEN
100
3.2.2
NACHWEIS
DER
EXPRESSION
DER
HYBRIDREZEPTOREN
RLY
UND
RLLA
IN
BA/F3-ZELLEN
MITTELS
SDS
PAGE
UND
DETEKTION
MIT
P5D4-ANTIKOERPER
101
3.23
PROLIFERATIONSTEST
(
3
H-THYMIDINEINBAU)
DER
TRANSSSZIERTEN
BA/F3-ZELLIMEN
MIT
BMP2
103
3.24
SUBKLONIERUNG
DER
POSITIV
TRANSFIZIERTEN
BA/F3-ZELLINIEN
MIT
RLY
UND
RUA
104
3.25
NACHWEIS
DER
EXPRESSION
DER
SUBKLONE
DER
HYBRIDREZEPTOREN
RLY
IN
BA/F3-ZELLEN
MITTELS
SDS
PAGE
UND
DETEKTION
MIT
P5D4-ANTIKOERPER
104
3.2.6
NACHWEIS
DER
EXPRESSION
DER
SUBKLONE
DER
HYBRIDREZEPTOREN
RLLA
IN
BA/F3-ZELLEN
MITTELS
SDS
PAGE
UND
DETEKTION
MIT
P5D4-ANTIKOERPER
106
3.27
NACHWEIS
DER
DOPPELEXPRESSION
DER
SUBKLONE
DER
HYBRIDREZEPTOREN
RLY
UND
RLLA
IN
BA/F3
ZELLEN
MITTELS
SDS-PAGE
UND
DETEKTION
MIT
P5D4-ANTIKOERPER
107
3.28
PROLIFERATIONSTEST
(
3
H-THYMIDINEINBAU)
DER
SUBKLONE
DOPPELTRANSFEKTANTEN
RLY/RIIA
MIT
BMP2
108
3.29
PROLIFERATIONSTEST
(
3
H-THYMIDINEINBAU)
DER
SUBKLONE
RITA
MIT
BMP2
UND
P5D4-ANTIKOERPER
108
3.2.10
AUFREINIGUNG
DES
ANTIKOERPERS
MOUSE
IGGPP5D4
AUS
ZELLUEBERSTAND
111
3.2.11
PROLIFERATIONSTEST
(
3
H-THYMIDINEINBAU)
DER
SUBKLONE
DOPPELTRANSFEKTANTEN
RLY/RIIA
MIT
ANTIKOERPER
P5D4
MOUSE
IGGI
112
3.212
DETEKTION
VON
REZEPTOREN
MIT
P5D4-EPITOP
AUF
ZELLOBERFLAECHEN
MITTELS
LUMINOL
116
4
DISKUSSION
119
4.1
TRANSFEKTLON
DER
HYBRIDPLASMIDE
PKCRRIC
UND
PKCRP54RII4
IN
BA/F3-ZELLEN
UND
SUBKLONLERUNG
119
4.2
PROLIFERATIONSTEST
(
3
H-THYMLDLNELNBAU)
TRANSFIZIERTER
BA/F3-ZELLEN
MIT
BMP2
UND
AP5D4
119
4.21
STIMULATION
TRANSFIZIERTER
BA/F3-ZELLEN
MIT
BMP2
119
4.2.2
STIMULATION
TRANSFIZIERTER
BA/F3-ZELLEN
MIT
AP5D4
121
4.3
OBERFLAECHENEXPRESSION
DER
HYBRIDREZEPTOREN
RLY
UND
RLLA
AUF
BA/F3-ZELLEN
122
4.3.1
OBERFLAECHENDETEKTION
DER
HYBRIDREZEPTOREN
RLY
UND
RITA
MITTELS
CHEMOLUMINESZENS
122
4.3.2
OBERFLAECHENEXPRESSION
DER
HYBRIDREZEPTOREN
RLY
UND
RITA
AUF
BA/F3-ZELLEN
123
4.4
AUSBLICK
130
5
ZUSAMMENFASSUNG
131
6
LITERATURVERZEICHNIS
134
DANKSAGUNG
LEBENSLAUF
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